"OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE FABRICACIÓN DE UNA FORMULACIÓN LIOFILIZADA PARA LA OBTENCIÓN DEL RADIOFÁRMACO 99mTc-EDDA/HYNIC-E-[c(RGDfK)]2”

Los péptidos basados en la secuencia cíclica Arg-Gly-Asp (RGD) se han reportado como agentes con gran afinidad para integrinas v3 y v5 sobre-expresadas en procesos angiogénicos tanto en las células endoteliales como en las células de cáncer de mama y glioblastomas. La integrina v3 está expresada en bajos niveles sobre las células epiteliales y endoteliales maduras, pero está altamente expresada sobre las células endoteliales activadas en la neovasculatura de tumores, incluyendo osteosarcomas, neuroblastomas, glioblastomas, melanomas, carcinomas de pulmón y cáncer de mama. La expresión de la integrina αvβ3 correlaciona bien con la progresión e invasividad del tumor en cánceres de mama, ovario, glioma y melanoma. La angiogénesis es un proceso crítico del tumor para su crecimiento y metástasis. Por su expresión altamente definida durante la iniciación, el crecimiento, invasión y metástasis del tumor, las integrinas representan un blanco molecular importante para el diagnóstico temprano de tumores agresivos de rápido crecimiento y metástasis. En este trabajo se optimizó el proceso de producción de una formulación farmacéutica liofilizada para la preparación del radiofármaco 99mTc-EDDA/HYNIC-E-[c(RGDfK)]2, se demostró la unión específica a las integrinas v3 para ser empleada en los gabinetes de medicina nuclear en la obtención de imágenes gammagráficas para la detección oportuna de cáncer de mama. La formulación farmacéutica liofilizada óptima para la preparación del radiofármaco 99mTc-EDDA/HYNIC-E-[c(RGDfK)]2 se estableció como: HYNIC-E-[c(RGDfK)]2 25 µg Cloruro estanoso (SnCl2) 20 µg Ácido Etilendiaminodiacético (EDDA) 10 mg N-tris(hidroximetil)metilglicina (Tricina) 20 mg Manitol 50 mg Los resultados de pureza radioquímica de la formulación estéril y libre de endotoxinas bacterianas para los tres lotes de validación preparados bajo protocolos de Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) fueron 97.62 ± 1.48 %, 96.54 ± 1.89 %, y 97.66 ± 0.57 %, por lo que el procedimiento de producción cumple las especificaciones preestablecidas. El radiofármaco 99mTc-EDDA/HYNIC-E-[c(RGDfK)]2 preparado a partir de la formulación farmacéutica liofilizada mostró ser estable durante al menos 24 horas, por lo que puede ser empleado en los centros de medicina nuclear molecular. Se obtuvieron imágenes in vivo de la sobre-expresión de integrinas v3 a partir del radiofármaco 99mTc-EDDA/HYNIC-E-[c(RGDfK)]2 obtenido de la formulación farmacéutica liofilizada y optimizada. La formulación farmacéutica liofilizada (HYNIC-RGD-Sn) mostró ser estable durante 12 meses, por lo que se solicitó la autorización de este periodo de caducidad a la COFEPRIS (Número de ingreso 123300401A0155)

Cytokines, integrins and the pathogenesis of malaria

Faculdade de Medicina (FMD

Determinação do padrão de distribuição de algumas moléculas envolvidas na somitogénese

Relatório de projecto no âmbito de Bolsa Universidade de Lisboa/Fundação Amadeu Dias (2008/2009)Laboratório: Biologia do Desenvolvimento – FCUL/CBAUniversidade de Lisboa; Fundação Amadeu Dia

Imunodeficiências primárias dos fagócitos: prognóstico e terapêutica

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências FarmacêuticasAs imunodeficiências primárias são a consequência de anomalias genéticas que ocorrem no sistema imunológico. Dentro dos vários grupos de imunodeficiências primárias estão inseridas as imunodeficiências primárias dos fagócitos, que resultam de defeitos congénitos que afetam o número e/ou função das células fagocitárias. Estas células têm um papel importante na defesa e homeostasia do organismo, uma vez que permitem a eliminação de microrganismos patogénicos, de agentes estranhos e de outras células. Uma disfunção ao nível dos fagócitos desencadeará uma maior suscetibilidade para infeções e outros tipos de enfermidades. As imunodeficiências primárias dos fagócitos podem ser classificadas em vários grupos de doenças, de acordo com o componente fagocitário afetado. Para essas doenças existem uma serie de tratamentos, e apesar de alguns ainda se encontrarem em fase de estudo, as técnicas que hoje em dia se utilizam têm melhorado bastante o prognóstico dos pacientes, permitindo-lhes uma maior qualidade de vida e uma diminuição da mortalidade. Primary immunodeficiencies are the result of genetic abnormalities that happen in the immune system. Within the many groups of primary immunodeficiencies are inserted primary immunodeficiencies of phagocytes, which result from birth defects that affect the number and/or function of phagocytic cells. These cells are important in the organism defense and homeostasis, because they allow the elimination of pathogens, strange agents and other cells. A phagocyte dysfunction increases the susceptibility to infections and other diseases. Primary immunodeficiencies of the phagocytes can be classified in several groups of diseases, according to the component of phagocytic system that is affected. For these diseases there are several treatments, and although some still in a study phase, the techniques that are used today have greatly improved the prognosis of patients providing them a higher quality of life and decreased mortality

Involvement of integrins in the adhesion of osteoblastic cells to a type-I collagen matrix

Se han desarrollado varios biomateriales con potencial aplicaci ón en la reconstrucción de tejidos. En este sentido, existe un creciente interés en el diseño de materiales de implante óseo con máxima biocompatibilidad y adecuada adhesividad celular. El objetivo de este trabajo fue estudiar cuáles receptores integrinas participan en la adhesión de osteoblastos a una matriz de colágeno tipo-I. Se analizaron dos líneas celulares osteoblásticas: UMR106, derivada de osteosarcoma de rata; y MC3T3E1, derivada de calvaria de rata. Las células se cultivaron durante una hora sobre plástico, o sobre un gel de colágeno tipo-I, solas o co-incubadas con diferentes péptidos: (a) péptido-b, un oligopéptido de 13 aminoácidos que corresponde a la secuencia conservada 113-125 de la subunidad b de los receptores integrinas; (b) RGD (Arg-Gly-Asp), que corresponde a la secuencia de reconocimiento de la subunidad a de las integrinas a1,5b1; o (c) DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala), la secuencia de reconocimiento de la subunidad a de las integrinas a2b1. La adhesión y la inducción de extensiones celulares se evaluaron microscópicamente luego de lavar, fijar y colorear las células con Giemsa. Los resultados demostraron que las células osteoblásticas se adhieren más fácilmente a un sustrato de colágeno tipo-I que al plástico (86 ± 5 células/campo vs. 69 ± 4 células/campo para colágeno tipo-I vs. plástico, respectivamente, p < 0,02). El péptido-b inhibió la adhesión de ambas líneas celulares a una matriz de colágeno y el efecto inhibidor mostró dependencia dosis-respuesta. Por otro lado, este péptido indujo en las células tipo osteoblastos UMR106 un aumento del agrupamiento intercelular, y una reducción en la inducción de extensiones celulares. Estos cambios morfol ógicos podrían estar indicando un incremento en las interacciones célulac élula y una disminución en las interacciones célula-matriz, posiblemente inducidos por el péptido-b. De forma similar, los péptidos RGD y DGEA disminuyeron significativamente, entre un 20 y 30 %, la adhesión de las células UMR106 y MC3T3E1 a la matriz de colágeno. Las células UMR106 cultivadas sobre colágeno en presencia de DGEA mostraron un mayor estiramiento citoplasmático, con inducción de extensiones celulares en múltiples direcciones. En suma, estos resultados sugieren que las subunidades a y b de varios receptores integrinas están involucradas en la adhesión de las células tipo osteoblastos a una matriz de colágeno tipo-I. Así, el recubrimiento de ciertos biomateriales con péptidos de reconocimiento o con mol éculas de colágeno intacto, podría mejorar la osteointegración de implantes para la reparación del tejido óseo.Several biomaterials have been developed with applications in bone tissue engineering. In this context, there is a growing interest in developing bone implant materials with improved biocompatibility and cell adhesion properties. The aim of this study was to research which integrin receptors participate in the attachment of osteoblastic-like cells to a type- I collagen matrix. Two osteoblast-like cells, the UMR106 rat osteosarcoma cell line and the MC3T3E1 mouse calvaria- derived cells, were analyzed. Cells were plated for one hour either on plastic or a type-I collagen film, alone or co-incubated with different peptides: (a) b-Peptide, a 13-aminoacid oligopeptide corresponding to preserved sequence 113-125 of the b-subunit of integrin receptors; (b) RGD (Arg-Gly-Asp), which corresponds to the a-subunit recognition sequence of a1,5b1 integrins; or (c) DGEA (Asp-Gly- Glu-Ala), the a-subunit recognition sequence of a2b1 integrins. Cell adhesion and spreading were evaluated microscopically after fixing and staining the cells with Giemsa. The results showed that osteoblast-like cells adhere more easily to a type-I collagen substratum than to plastic (86 ± 5 cells/ field vs. 69 ± 4 cells/field for type-I collagen vs. plastic, respectively, p < 0.02). The b-peptide inhibited the adhesion of both cell lines to the collagen matrix in dose-dependent way. Addition-ally, this peptide induced an increase in UMR106 cells clumping and a decrease in cells spreading. These morphological features would suggest an increase in cell-cell interactions and a decrease in cell-matrix interactions, possibly mediated by b-peptide. The RGD and DGEA peptides significantly decreased UMR106 and MC3T3E1 adhesion to the collagen matrix (ranging from 20 to 30 % inhibition). On the other hand, UMR106 cells grown on collagen in the presence of DGEA exhibited greater spreading with cellular extensions in multiple directions. Altogether, the obtained results suggest that both a and b subunits of several integrin receptors are involved in the attachment of osteoblast-like cells to a type-I collagen matrix. The coating of different biomaterials with specific recognition peptides as well as with whole collagen molecules, could improve the boneintegration of implants to be used in bone tissue repairing

Extracellular matrix and integrins influence in the regulation of myogenic precursor cells behaviour

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Molecular Humana), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasMyogenesis is the process by which undifferentiated dermomyotomal cells are specified for myogenesis, move towards the myotome where they differentiate into skeletal muscle cells that fuse into myotubes and later in development form myofibers which will constitute the skeletal muscles of the adult. The muscle precursor cells arise from the dermomyotome, an epithelial-like structure that is the source for skeletal muscle and dorsal dermis cells. Some cells, called satellite cells, go throughout part of this differentiation process but remain in a quiescent undifferentiated state (although committed to skeletal muscle fate). These cells are activated in the adult in case of muscle injury or enhanced exercise, for example. In this work we used a satellite cell-derived cell line, C2C12, and the mouse embryo to study the extracellular matrix (ECM) and integrins influence in myogenic determination and differentiation. Integrins are heterodimeric ECM receptors constituted by an α and a ß subunit that can induce, for example, migration or differentiation. The integrin ligand specificity is acquired by the combination of both subunits. Our studies have addressed that laminin-α6ß1 integrin interaction may be coordinating with Notch signaling the maintenance of undifferentiated dermomyotomal cells. By inhibiting Notch signaling, we observed precocious myogenic differentiation of dermomyotomal cells (by Myf5 expression) and the assembly of a laminin matrix around these cells. This result suggests that Myf5 induces laminin assembly. In vitro, fibronectin enhances C2C12 myoblasts alignment and migration. When we observed the myotubes of cells grown on fibronectin, we believe that the enhanced cell alignment imposed by fibronectin-α5ß1 integrin interaction will facilitate cell fusion. In vivo, we found that fibronectin is important for dermomyotome epithelial-integrity, especially through the polarization of N-cadherin, and that α5ß1 integrin signaling may also contribute to myogenic repression in the dermomyotome. These observations show that the ECM and integrins are of paramount importance in myoblast cell behaviour.Resumo alargado em português disponível no document