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    Process Development Tools for Cross-Flow Filtration in Biopharmaceutical Downstream Processing

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    In der modernen Medizin sind biopharmazeutische Proteine wichtige Substanzen für die Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten wie Lymphomen bzw. Hepatitis B. Diese Proteine haben eine komplexe Struktur, die eine biologische Synthese in Zellen erfordert, und ihre parenterale Verabreichung bedarf einer anschließenden Reinigung. Abschließend muss das Protein in einer Flüssigkeit formuliert werden, die eine gewisse Haltbarkeit und physiologische Verträglichkeit gewährleistet. Die Gewinnung des Proteins aus der Zellbrühe, die Reinigung und die Formulierung werden als downstream processing (DSP) bezeichnet. Jeder Prozessschritt im DSP wird mit einer Grundoperation durchgeführt, eine davon ist die Querstromfiltration (cross-flow filtration, CFF), auch bekannt als Tangentialflussfiltration (TFF). Bei der CFF werden die Proteine durch Größenausschluss von Verunreinigungen oder der umgebenden flüssigen Phase getrennt, wobei der Trennmechanismus im Idealfall von anderen Proteineigenschaften wie Ladung oder Hydrophobizität entkoppelt ist. Der Größenausschluss wird durch poröse Membranen realisiert. Im DSP biopharmazeutischer Proteine kann die CFF für die Zellseparation, die Reinigung und die finale Formulierung eingesetzt werden. Letztere besteht in der Regel aus einer Kombination von Pufferaustausch und Konzentrationserhöhung, die als Ultrafiltration/Diafiltration (UF/DF) bezeichnet wird. Im Vergleich zur herkömmlichen Normalstromfiltration wird der Zulaufstrom bei der CFF parallel zur Membranoberfläche gerichtet und das Filtrat dringt durch die Poren der Membran. Daher führt die CFF zu einer geringeren Anreicherung der zurückgehaltenen Spezies an der Membranoberfläche und somit zu schnelleren Prozessen und weniger konzentrationsabhängiger Aggregation. Trotz dieser Vorteile ist die Prozessentwicklung für die CFF mit einigen Herausforderungen verbunden: Diese sind zeit- und materialaufwändige Experimente, begrenzte Reinigungsleistung und Abweichungen der Ionenkonzentrationen vom Zielwert bei hohen Proteinkonzentrationen. Im DSP stehen mehrere Werkzeuge für die Prozessentwicklung und -optimierung zur Verfügung, zum Beispiel Prozessintegration, Hochdurchsatz-Screenings (high-throughput screenings, HTS), prozessanalytische Technologie (process analytical technology, PAT) und mechanistische Modellierung. Im Vergleich zu anderen Grundoperationen, wie zum Beispiel der Chromatographie, werden diese Werkzeuge jedoch nur selten für die CFF eingesetzt. Das Ziel dieser Arbeit war es, Lösungen für die genannten Herausforderungen zu finden, indem diese Werkzeuge in speziellen Fallstudien eingesetzt werden. Zudem war es Ziel dieser Arbeit, Erkenntnisse aus diesen Fallstudien zu gewinnen, um die Auswahl der Werkzeuge zur Entwicklung von CFF-Prozessen im biopharmazeutischen DSP zu erweitern. In Kapitel 1 dieser Arbeit wird einen Überblick über DSP-Ansätze für die beiden in dieser Arbeit exemplarisch verwendeten Biopharmazeutika, virusähnliche Partikel (virus-like particles, VLPs) und monoklonale Antikörper (monoclonal antibodies, mAbs), gegeben. VLPs sind nicht-infektiöse virale Partikel, denen das virale Genom fehlt. Nicht-umhüllte VLPs bestehen aus Proteinuntereinheiten, die sich in der produzierenden Zelle spontan zu Kapsiden zusammensetzen. VLPs werden meist während des DSP zerlegt und neu zusammengesetzt, um ihre Homogenität, Stabilität und Immunogenität zu verbessern. Biopharmazeutische Anwendungen von VLPs sind Impfstoffe und potenzielle therapeutische Impfstoffe oder Vektoren für die Ein-schleusung anderer Moleküle. MAbs sind Immunglobuline, die aus vier kovalent gebundenen Proteinketten bestehen. Im Vergleich zu mAbs sind die meisten VLPs um mehr als eine Größenordnung größer in Durchmesser und Molekulargewicht. MAbs gehören zu den am häufigsten zugelassenen Biopharmazeutika für den menschlichen Gebrauch und finden unter anderem bei der Behandlung von Krebs- und Entzündungskrankheiten Anwendung. Außerdem werden in Kapitel 1 Grundlagen und Anwendungen der CFF erläutert. Abschließend werden Hintergrundwissen und aktuelle Forschung zu den angewandten Werkzeugen der Prozessentwicklung dargestellt. Alternative Trennverfahren zur chromatographischen Reinigung weisen häufig eine geringere Trennleistung auf und sind schlecht skalierbar. Die wichtigsten Messgrößen für die Prozessleitung im DSP sind Reinheit und Produktivität. Beide können durch Prozessintegration verbessert werden, die durch die Kombination von Grundoperationen in einem gemeinsamen Arbeitsraum oder deren nahtlose Verbindung erreicht wird. In Kapitel 3 wird die Anwendung der Prozessintegration zur Verbesserung der Prozessleistung und der Skalierbarkeit des DSP von nicht-umhüllten VLPs vorgestellt. Dazu wurden die VLP-Fällung, -Wäsche und -Rücklösung mit CFF kombiniert. Es wurde eine Steuerung der Permeatflussrate implementiert, die die Verdichtung des Präzipitats an der Membranoberfläche reduzierte. Im Vergleich zur Abtrennung des Präzipitats mittels Zentrifugation, führte dieser Ansatz zu einer verbesserten Reinheit und Produktivität sowie zu einem höheren Automatisierungsgrad. Die Steuerung der Permeatflussrate ermöglichte auch die zusätzliche Integration von multimodaler Größenausschlusschromatographie (size exclusion chromatography, SEC) in den Rücklösungsstrom und damit eine weitere Verbesserung der Reinheit. Die in-line-Überwachung der Absorbanz von ultraviolettem Licht (UV) und die Produktfraktionierung wurden implementiert, um die Reinheit auf der Grundlage von datengesteuerten Entscheidungen während des Prozesses zu verbessern. Die vorgestellten Maßnahmen führten zu einem integrierten Abtrennungs- und Reinigungsschritt mit flexibler Skalierbarkeit und großem Potenzial für eine vollständige Automatisierung. Die Trennleistung war außerdem vergleichbar mit kompletten DSP-Ansätzen in der Literatur. Durch die Integration mehrerer Trenntechniken wurden Synergien geschaffen, die die Leistungsgrenzen der einzelnen Techniken überwinden. Der resultierende DSP-Ansatz basiert ausschließlich auf größenselektiven Trenntechniken, die den Größenunterschied von VLPs zu üblichen Verunreinigungen ausnutzen. Dieser Größenunterschied gilt für die meisten VLPs und verspricht somit eine breite Anwendbarkeit des vorgestellten DSP-Ansatzes. In der biopharmazeutischen Entwicklung ist die Verfügbarkeit von Proteinmaterial oft begrenzt, während die CFF vergleichsweise große Mengen für experimentelle Studien benötigt. In Kapitel 4 werden diese Herausforderungen adressiert, indem ein Ansatz zur Prozessentwicklung für Proteinreaktionen, die durch eine Änderung der Flüssigphase angetrieben werden, vorgestellt wird. Als Fallstudie wurde die Zerlegung von nicht-umhüllten VLPs untersucht. Sie kann durch eine Änderung der Flüssigphase ausgelöst werden, zum Beispiel durch eine Erhöhung des pH-Werts und der Harnstoffkonzentration. Um die optimalen Flüssigphasenbedingungen für die Zerlegung von VLPs zu finden, wurden HTS in kleinen Volumina durchgeführt. Dazu wurden VLP-Lösungen mit Stammlösungen gemischt, um den Prozessbedingungen zu entsprechen, und unter Reaktionsbedingungen automatisch mittels SEC analysiert. Die daraus resultierenden hochauflösenden Daten ermöglichten die Charakterisierung der Zerlegung der VLPs im Hinblick auf die CFF-basierte Prozessierung. Die optimalen Bedingungen wurden dann in einem DF-Prozessschritt im Labormaßstab angewendet. Die nach der DF-basierten Prozessierung beobachtete höhere Ausbeute und Reinheit wurde auf eine kontrollierte Änderung der Flüssigphase, eine intensivere Durchmischung und die gleichzeitige Abreicherung von Verunreinigungen zurückgeführt. Darüber hinaus wurde der VLP-Zerlegungsschritt in eine Sequenz von filtrationsbasierten Prozess-schritten eingebettet, wodurch unerwünschte Spezies mit höherem Mole-kulargewicht deutlich reduziert wurden. Die ausschließliche Verwendung der Filtration als größenselektiver Trenntechnik macht den entwickelten Prozess unabhängig von anderen molekularen Proteineigenschaften und bietet daher das Potenzial für eine Plattformprozessierung von nicht-umhüllten VLPs im Allgemeinen. Der vorgestellte Ansatz zur Prozessentwicklung reduziert den Zeit- und Proteinbedarf durch die Entkopplung des Screenings der Bedingungen von der CFF-Entwicklung und bietet das Potenzial für eine umfassende Charakterisierung. Die in Kapitel 5 vorgestellte Studie zielte darauf ab, die Herausforderung der Materialbeschränkungen zu überwinden, indem das aus CFF-Experimenten gewonnene Wissen maximiert wird. Dazu wurde ein PAT-Konzept für denselben Prozessschritt der Zerlegung von VLPs entwickelt, der in Kapitel 4 vorgestellt wird. Eine Reihe von PAT-Sensoren wurde unter verschiedenen Prozessbedingungen evaluiert. Parameter der Filtration wie Drücke, Durchflussraten und Pufferaustausch wurden in-line überwacht. Der Fortschritt der Zerlegung der VLPs wurde on-line mittels UV-Absorbanz und statischer Lichtstreuung qualitativ überwacht. Die Analyse der zweiten Ableitung der UV-Spektren zeigte außerdem Veränderungen in der Tertiärstruktur der Proteinuntereinheiten während der VLP-Zerlegung. Die on-line Überwachung der dynamischen Lichtstreuung zeigte Potenzial als qualitativer Indikator für unerwünschte Proteinaggregation. Regressionsmodelle, die UV-Daten als Eingangsgröße und die Konzentration der VLP-Untereinheiten als Ausgangsgröße verwenden, wurden kalibriert und anhand von at-line SEC-Daten als Referenz validiert. Mit Hilfe der Modelle wurden die Konzentrationen der Untereinheiten und damit der Fortschritt der VLP-Zerlegung präzise vorausgesagt. Die Vorhersagen wurden erfolgreich zur Erkennung von Prozessendpunkten eingesetzt. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass unverarbeitete univariate Signale von UV und statischer Lichtstreuung den Prozessendpunkt erfolgreich erkennen, was einen einfachen Ansatz für die großtechnische Herstellung darstellt. Insgesamt liefert das entwickelte PAT-Konzept prozess- und produktbezogene Daten in (nahezu) Echtzeit, was eine umfassende Überwachung, Charakterisierung und Endpunktdetektion ermöglicht. Der vorgestellte Ansatz hat großes Potenzial zur Charakterisierung der Zerlegung anderer VLPs oder von Reaktionen, die eine Veränderung der Partikelgröße oder der tertiären Proteinstruktur mit sich bringen. Die Formulierung biopharmazeutischer Proteine mittels UF/DF wird mit steigender Proteinkonzentration anspruchsvoller. Die Anreicherung von geladenen Proteinen führt zu einer ungleichmäßigen Verteilung von geladenen Hilfsstoffen durch die Membran, was als Gibbs-Donnan-Effekt bezeichnet wird. Dieser Effekt führt zu Abweichungen des pH-Werts und der Konzentration der Hilfsstoffe von den Zielbedingungen. Diese Abweichungen können durch den Volumenausschlusseffekt oder die Abhängigkeit der pK-Werte von der Ionenstärke noch verstärkt oder verringert werden. Das komplexe Geflecht dieser voneinander abhängigen Phänomene erschwert einfache oder generische Abschätzungen der endgültigen Zusammensetzung. In Kapitel 6 wird die Entwicklung und Validierung eines mechanistischen Modells vorgestellt, das die genannten Phänomene und Wechselwirkungen beschreibt. Ziel der Studie war es, ein besseres Verständnis der Modellvariablen zu erlangen und die Zusammensetzung während UF/DF-Prozessen mit hohen Konzentrationen vorherzusagen. Derzeit verfügbare Modelle beschreiben und validieren den Bereich hoher Proteinkonzentrationen über 100 gL^{-1} nur unzureichend oder erfordern eine experimentelle Kalibrierung. Es wurde ein mechanistisches Modell entwickelt, das auf der Poisson-Boltzmann-Theorie und einem grundlegenden Stern-Modell basiert, um die elektrostatischen Wechselwirkungen von Proteinen und geladenen gelösten Stoffen zu beschreiben. Ein besonderer Fokus bei der Entwicklung lag auf hohen Proteinkonzentrationen. Das Modell wurde außerdem so konzipiert, dass als Eingangsvariablen lediglich üblicherweise bekannte theoretische Informationen über das Protein und die Pufferzusammensetzung benötigt werden. Das Modell wurde anhand umfassender experimenteller Daten kompletter UF/DF/UF-Sequenzen von mAbs und verschiedenen Flüssigphasenbedingungen sorgfältig validiert. Die Vorhersagen des Modells zeigten im Vergleich zu bestehenden Ansätzen eine bessere Genauigkeit im Bereich hoher Konzentrationen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das entwickelte Modell und die angewandte Validierungsstrategie ein tieferes Verständnis von UF/DF-Modellen, die auf der Poisson-Boltzmann Theorie basieren, ermöglichen. Das rein prädiktive Modell ermöglicht ein systematisches in silico Design von hochkonzentrierten UF/DF-Schritten, ohne dass Proteinmaterial benötigt wird. Abschließend kann gesagt werden, dass Prozessintegration, HTS, PAT und mechanistische Modellierung erfolgreich für die Entwicklung von CFF-Prozessen implementiert und zur Verbesserung der Prozessleistung, des Proteinbedarfs und der Entwicklungszeiten eingesetzt wurden. Diese Arbeit liefert somit potenzielle Lösungen für die Herausforderungen in der biopharmazeutischen CFF-Prozessentwicklung auf der Grundlage von konkreten Fallstudien. Zusätzlich zu diesen Lösungen bieten die entwickelten CFF-Prozesse neue Ansätze für die größenselektive Aufreinigung von nicht-umhüllten VLPs und damit Bausteine für ein Plattform-DSP. Für die Modellierung der Zusammensetzung während der UF/DF von hochkonzentrierten mAb-Formulierungen wird ein umfassendes Verständnis der Modellvariablen und der Gültigkeit der Annahmen erarbeitet. Diese Arbeit zur Erweiterung des Forschungsstandes zur CFF-Prozessentwicklung durch fortschrittliche Entwicklungsansätze und Prozessdesigns bei

    The Biologically Sensitive Area: A review of the basis and effectiveness

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    The Biologically Sensitive Area (BSA) designation is a multiuse area of protection to the south and west of Ireland. The BSA was established within a political context based on three core ideas, namely: (1) to prevent overfishing, (2) protect hake stocks and (3) protect spawning and nursery areas found in this area. The area was established in 2003 to limit fishing within the area, and replaced the previous larger ‘Irish Box’ which had surrounded Ireland.EMF

    Characterization Of Infectious Isolates Of Borrelia Burgdorferi In North Dakota, Bb0399 And Bbb28 In B. Burgdorferi, And Borrelia Miyamotoi In Vitro And In Vivo

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    The Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.) complex contains species carried by hard-shell ticks (Ixodes spp.) and causing Lyme disease and related non-pathogenic species. Relapsing fever Borrelia include both tick-borne (soft-shell, Ornithodoros spp.) and louse-borne species knowns to cause relapsing fever. A subgroup includes relapsing fever spirochetes carried by hard-shell ticks, including B. miyamotoi, an emerging pathogen. Despite bordering high-risk counties in Minnesota, little attention has been given to Lyme disease, B. burgdorferi, I. scapularis, or reservoirs in eastern North Dakota. Reports of B. burgdorferi and I. scapularis in North Dakota, however, prompted a more detailed examination. Through trapping Peromyscus and Myodes, five B. burgdorferi populations were obtained. We confirmed the presence of established, unique (nonclonal), and infectious B. burgdorferi populations in eastern North Dakota. Species of the B. burgdorferi s.l. complex possess two highly conserved hypothetical genes, bb0399 and bbb28, containing one of the most common protein motifs, ankyrin-repeat domains. The goal was to identify the function(s) of bb0399 and bbb28. Our hypothesis was BB0399 is an essential DNA binding protein and BBB28 is regulated by the Borrelia oxidative stress response regulator, BosR in response to an unknown stimuli. Exposing B. burgdorferi to tert-butyl hydroperoxide increased transcription of bbb28 but not bb0399. Several attempts to express recombinant BB0399 and BBB28 failed and the functions of bb0399 and bbb28 remain unknown. B. miyamotoi is an emerging pathogen vectored by the same Ixodes spp. carrying and transmitting B. burgdorferi. B. miyamotoi binds human factor H in vitro. C57BL/6J Rag1-/- mice infected with a Japanese strain of B. miyamotoi, FR64b, developed a chronic infection, while both 2-4 and 6-8 week-old wild-type C3H/HeN groups cleared B. miyamotoi. B. miyamotoi FR64b, normally vectored by I. persulcatus, was acquired by North American I. scapularis and maintained B. miyamotoi throughout the molting process from larvae to nymph, suggesting unlike other relapsing fever Borrelia, B. miyamotoi is not vector specific

    Sequence Determinants of the Individual and Collective Behaviour of Intrinsically Disordered Proteins

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    Intrinsically disordered proteins and protein regions (IDPs) represent around thirty percent of the eukaryotic proteome. IDPs do not fold into a set three dimensional structure, but instead exist in an ensemble of inter-converting states. Despite being disordered, IDPs are decidedly not random; well-defined - albeit transient - local and long-range interactions give rise to an ensemble with distinct statistical biases over many length-scales. Among a variety of cellular roles, IDPs drive and modulate the formation of phase separated intracellular condensates, non-stoichiometric assemblies of protein and nucleic acid that serve many functions. In this work, we have explored how the amino acid sequence of IDPs determines their conformational behaviour, and how sequence and single chain behaviour influence their collective behaviour in the context of phase separation. In part I, in a series of studies, we used simulation, theory, and statistical analysis coupled with a wide range of experimental approaches to uncover novel rules that further explore how primary sequence and local structure influence the global and local behaviour of disordered proteins, with direct implications for protein function and evolution. We found that amino acid sidechains counteract the intrinsic collapse of the peptide backbone, priming the backbone for interaction and providing a fully reconciliatory explanation for the mechanism of action associated with the denaturants urea and GdmCl. We discovered that proline can engender a conformational buffering effect in IDPs to counteract standard electrostatic effects, and that the patterning those proline residues can be a crucial determinant of the conformational ensemble. We developed a series of tools for analysing primary sequences on a proteome wide scale and used them to discover that different organisms can have substantially different average sequence properties. Finally, we determined that for the normally folded protein NTL9, the unfolded state under folding conditions is relatively expanded but has well defined native and non-native structural preferences. In part II, we identified a novel mode of phase separation in biology, and explored how this could be tuned through sequence design. We discovered that phase separated liquids can be many orders of magnitude more dilute than simple mean-field theories would predict, and developed an analytic framework to explain and understand this phenomenon. Finally, we designed, developed and implemented a novel lattice-based simulation engine (PIMMS) to provide sequence-specific insight into the determinants of conformational behaviour and phase separation. PIMMS allows us to accurately and rapidly generate sequence-specific conformational ensembles and run simulations of hundreds of polymers with the goal of allowing us to systematically elucidate the link between primary sequence of phase separation

    2017 Abstract Book

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    Development of new immunoassay platforms for rapid serological diagnosis of Lyme borreliosis

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    The presented work describes the development of new ligand-binding assay platforms for rapid serological diagnosis. 3-D polyethylene sinter bodies and monodisperse gold nanoparticles have been successfully employed as protein carriers, providing sensitive, selective and rapid serological diagnosis. Detection of anti-Borrelia antibodies in human sera samples was taken as a model in our work. Antibodies recognition either by visible observation or by spectroscopic measurements was easily practicable. All developed assays could be performed in a short time, 5-30 min, providing a suitable colorimetric point of care test. The established assays offer simple, rapid and reliable tools of analysis with minimal cost, which can be easily transferred to other infectious diseases

    Molecular phylogenetics, biodiversity and life history evolution of Yponomeutoidea (Lepidoptera: Ditrysia), with a catalog and an overview of the lepidopteran fossils

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    Yponomeutoidea, one of the earliest-branching superfamilies of advanced (ditrysian) Lepidoptera, comprise about 1,800 species worldwide, including notable pests and models of insect-plant interaction. Yponomeutoids were one of the earliest lepidopteran clades to evolve external feeding and to colonize extensively herbaceous angiosperms. Despite the group's economic importance, and its value for tracing early lepidopteran evolution, the biodiversity and phylogeny of Yponomeutoidea have been relatively little studied. Even the monophyly and composition of the superfamily have been in doubt. In this dissertation, the most detailed molecular phylogeny to date for Yponomeutoidea is presented (Chapter 1). The resulting phylogeny is compared to previous morphological evidence, and its implications for evolutionary trends in yponomeutoid host association and biogeography are explored. As a prerequisite to divergence dating in the Yponomeutoidea, which is necessarily based on outgroup fossils as none are known for yponomeutoids, a general summary and overview of the lepidopteran fossil record (Chapter 2) is provided, based a recent, comprehensive catalog of known fossils. For chapter 2, all known lepidopteran fossils have been catalogued with annotations of their preservation, specimen deposition, fossil localities and ages (Chapter 3). As a contribution toward better characterization of yponomeutoid biodiversity, taxonomic reviews are provided for the New World genera Eucalantica and Atemelia (Chapter 4). The molecular phylogeny estimate (Chapter 1) is based on 8-27 protein coding nuclear genes sequenced in 86 Yponomeutoidea and 53 outgroups. Monophyly for Yponomeutoidea is corroborated. Results from different analyses are highly congruent and relationships within Yponomeutoidea are well supported overall. There is strong support overall for monophyly of families (or major parts thereof) previously recognized on morphological grounds, including Yponomeutidae, Ypsolophidae, Plutellidae, Glyphipterigidae, Argyresthiidae, Attevidae, Praydidae, Heliodinidae, and Bedelliidae. The formerly yponomeutid subfamily Scythropiinae are elevated to family rank (Scythropiidae stat. rev.). Host plant family associations of yponomeutoid subfamilies and families are non-random, but show no trends suggesting parallel phylogenesis, and are less conserved than is mode of feeding (e.g. internal versus external). My analyses reveal previously unrecognized tropical clades in several families, and suggest that previous characterization of yponomeutoids as predominantly Palearctic/ Holarctic was based on insufficient sampling
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