Updates in the field of hereditary nonpolyposis colorectal cancer : Expert Review of Gastroenterology & Hepatology

ABSTRACT Introduction Up to one third of colorectal cancers show familial clustering and 5% are hereditary single-gene disorders. Hereditary non-polyposis colorectal cancer comprises DNA mismatch repair-deficient and -proficient subsets, represented by Lynch syndrome (LS) and familial colorectal cancer type X (FCCTX), respectively. Accurate knowledge of molecular etiology and genotype-phenotype correlations are critical for tailored cancer prevention and treatment. Areas covered The authors highlight advances in the molecular dissection of hereditary non-polyposis colorectal cancer, based on recent literature retrieved from PubMed. Future possibilities for novel gene discoveries are discussed. Expert commentary LS is molecularly well established, but new information is accumulating of the associated clinical and tumor phenotypes. FCCTX remains poorly defined, but several promising candidate genes have been discovered and share some preferential biological pathways. Multi-level characterization of specimens from large patient cohorts representing multiple populations, combined with proper bioinformatic and functional analyses, will be necessary to resolve the outstanding questions.Peer reviewe

Whole Gene Capture Analysis of 15 CRC Susceptibility Genes in Suspected Lynch Syndrome Patients

Background and Aims Lynch Syndrome (LS) is caused by pathogenic germline variants in one of the mismatch repair (MMR) genes. However, up to 60% of MMR-deficient colorectal cancer cases are categorized as suspected Lynch Syndrome (sLS) because no pathogenic MMR germline variant can be identified, which leads to difficulties in clinical management. We therefore analyzed the genomic regions of 15 CRC susceptibility genes in leukocyte DNA of 34 unrelated sLS patients and 11 patients with MLH1 hypermethylated tumors with a clear family history. Methods Using targeted next-generation sequencing, we analyzed the entire non-repetitive genomic sequence, including intronic and regulatory sequences, of 15 CRC susceptibility genes. In addition, tumor DNA from 28 sLS patients was analyzed for somatic MMR variants. Results Of 1979 germline variants found in the leukocyte DNA of 34 sLS patients, one was a pathogenic variant (MLH1 c.1667+1delG). Leukocyte DNA of 11 patients with MLH1 hypermethylated tumors was negative for pathogenic germline variants in the tested CRC susceptibility genes and for germline MLH1 hypermethylation. Somatic DNA analysis of 28 sLS tumors identified eight (29%) cases with two pathogenic somatic variants, one with a VUS predicted to pathogenic and LOH, and nine cases (32%) with one pathogenic somatic variant (n = 8) or one VUS predicted to be pathogenic (n = 1). Conclusions This is the first study in sLS patients to include the entire genomic sequence of CRC susceptibility genes. An underlying somatic or germline MMR gene defect was identified in ten of 34 sLS patients (29%). In the remaining sLS patients, the underlying genetic defect explaining the MMRdeficiency in their tumors might be found outside the genomic regions harboring the MMR and other known CRC susceptibility genes

Candidate Germline Genetic Variants for Familial Colorectal Cancer Type X

Familial colorectal cancer type X (FCCTX) defines families that fulfill the Amsterdam criteria without evidence of defects in the DNA mismatch repair (MMR) genes and whose tumors do not present microsatellite instability. However, its genetic etiology remains unknown, therefore this study aimed to identify and evaluate novel variants and candidate genes that may play a role in FCCTX susceptibility. Based on a previous whole exome sequencing (WES) study in a FCCTX family, a bioinformatic analysis and a subsequent in silico and segregation studies were conducted to identify candidate genes and/or specific variants that may predispose for this syndrome. Since this analysis was already started, variants in 6 genes have already been identified to segregate with the disease. Therefore, the aim of this project was to continue this work by completing the selection of candidate variants and to characterize and try to clarify the role of these variants for FCCTX susceptibility. In order to elucidate the possible contribution of the corresponding genes for FCCTX, a mutational analysis was performed to search for germline mutations in index patients from FCCTX and FCCTX-like families. In addition, using the WES data, a copy number variation (CNV) analysis was also performed for the family subjected to WES, followed by a bioinformatic and in silico analysis to reveal amplicon deletions that may segregate with disease. It was also evaluated the involvement of the TPP2 gene, previously identified as a possible candidate gene for FCCTX in another family, in healthy and affected FCCTX patients, by mutational/splicing analysis, relative quantification by quantitative PCR and protein truncation test to assess resulting truncating proteins. The bioinformatic followed by in silico and segregation analysis of the variants obtained from WES, revealed 1 variant in the CACNA1S gene that segregated with the disease. Adding this variant to the already obtained, a total of 7 variants in different genes were found as possible contributors to FCCTX in this family. The segregation analysis also revealed the segregation of the previously identified MTMR3 and TAS1R1 variants in a patient from an older generation of the family. The CNV analysis revealed, after selective criteria, 22 amplicons of interest with a deletion scenario, for further segregation studies. The germline mutational analysis in a set of FCCTX and FCCTX-like families uncovered 2 and 3 potentially pathogenic variants for the MTMR3 and TAS1R1 genes, respectively. One of the variants found in MTMR3 was the same found in the WES analysis. Thus far no relevant variants were observed for LGR6 and DUSP12, however this analysis is not completed. The TPP2 study revealed the presence of non-described splicing isoforms. One of these isoforms exhibited a differential expression between healthy and affected individuals and the protein truncation test revealed that this alternative transcript gives rise to a truncated protein. In conclusion, the identification of more than one genetic variant appears to agree with the suggestion that FCCTX is a heterogeneous entity and the discovery of potentially pathogenic variants in MTMR3 and TAS1R1 reinforce their possible involvement in FCCTX. The alternative TPP2 transcript appears to be involved in the earlier stages of colorectal carcinogenesisO cancro do cólon e reto familiar do tipo X (FCCTX) define as famílias que preenchem os critérios de Amesterdão nas quais não é identificada mutação germinal nos genes de reparação de erros de DNA do tipo mismatch (MMR) e cujos tumores não apresentam instabilidade de microssatélites. Sendo a sua causa molecular desconhecida. Assim, o presente estudo teve como objetivo identificar e avaliar novas variantes e genes candidatos que possam estar envolvidos na suscetibilidade para o FCCTX. Com base num estudo prévio de whole exome sequencing (WES), realizado numa família FCCTX, foi efetuada uma análise bioinformática e in silico e um subsequente estudo de segregação, de modo a identificar genes candidatos e/ou variantes específicas que possam predispor para esta condição hereditária. Uma vez que esta análise já tinha sido iniciada, 6 variantes em diferentes genes, que segregaram com a doença, já tinham sido identificadas. Assim, o objetivo deste trabalho consistiu na continuação deste estudo, completando a seleção das variantes candidatas, e na caracterização e clarificação destas variantes para a suscetibilidade para o FCCTX. De modo a elucidar a possível contribuição destes genes para o FCCTX, foi realizada uma análise mutacional em indivíduos index de famílias FCCTX e potenciais famílias FCCTX. Adicionalmente, utilizando os resultados da WES, foi também realizada uma análise de copy number variantion (CNV) para a família integrada na análise de WES, seguida de uma análise bioinformática e estudos in silico de modo a avaliar a presença de deleções de amplicons que pudessem segregar com a doença. O envolvimento de transcritos alternativos do gene TPP2, previamente identificado como um possível gene candidato para o FCCTX noutra família, foi também avaliado em indivíduos saudáveis e afetados por análise mutacional/splicing, quantificação relativa por PCR quantitativo e teste da proteína truncada, para avaliar a existência de proteínas truncantes. A análise bioinformática seguida pela análise in silico e segregação das variantes obtidas por WES revelou a segregação com a doença de uma variante no gene CACNA1S. Tendo em conta as variantes já obtidas, foram identificadas 7 variantes em diferentes genes como possíveis intervenientes na suscetibilidade para o FCCTX nesta família. A análise de segregação revelou ainda a segregação das variantes dos genes MTMR3 e TAS1R1 num individuo proveniente de uma geração anterior. A análise de CNV revelou, após a introdução de critérios seletivos, 22 amplicons de interesse com um cenário de deleção, para estudos de segregação adicionais. A análise de mutações germinais num conjunto de famílias FCCTX e potenciais famílias FCCTX revelou 2 e 3 variantes potencialmente patogênicas para os genes MTMR3 e TAS1R1, respetivamente. Uma das variantes encontradas no gene MTMR3 correspondeu à variante encontrada no estudo de WES. Não foram observadas até ao momento variantes relevantes para os genes LGR6 e DUSP12, porém esta análise não está completa. O estudo do gene TPP2 revelou a presença de isoformas não descritas. Uma destas isoformas apresentou uma expressão diferencial entre o transcrito normal e o alternativo em indivíduos saudáveis e afetados e, o teste da proteína truncada revelou que este transcrito alternativo dá origem a uma proteína truncada. Em conclusão, a identificação de mais de uma variante genética parece concordar com a sugestão de que o FCCTX é uma entidade heterogénea, e a descoberta de variantes potencialmente patogénicas nos genes MTMR3 e TAS1R1 reforçam seu possível envolvimento no FCCTX. O transcrito alternativo do gene TPP2 parece estar envolvido numa fase inicial da carcinogénese colorretal

Estudo de regiões de susceptibilidade para o cancro do cólon e recto familiar do tipo x: análise de genes candidatos e de ganhos/deleções em tumores

Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Biologia Molecular em SaúdeO cancro do cólon e recto familiar do tipo X (FCCTX) define as famílias que preenchem os critérios de Amesterdão, mas nas quais não é identificada mutação germinal nos genes de reparação de erros de DNA do tipo mismatch (MMR) e cujos tumores não apresentam instabilidade de microsatélites. A sua causa molecular não é ainda conhecida. O presente trabalho teve como objectivo avaliar o envolvimento de genes localizados em duas regiões de susceptibilidade previamente identificadas (13q32-33 e 21q11) e o esclarecimento das perdas de heterozigotia (LOH) frequentes em 13q32-33 em tumores FCCTX, através de uma análise do número de cópias (copy number). Pretendeu-se ainda estudar o gene BMPR1A como gene de susceptibilidade para o FCCTX. Foi efectuada análise de mutações germinais dos genes HSPA13, SAMSN1 e BMPR1A em 15 indivíduos índex das famílias FCCTX e 2 familiares de uma das famílias. Foi ainda realizada, a nível germinal, a pesquisa de transcritos aberrantes dos genes TEX30 e SAMSN1 e quantificada a expressão destes e do HSPA13 por qPCR em 3 indivíduos índex e 6 familiares de uma das famílias FCCTX. Da mesma forma procedeu-se também ao estudo da expressão diferencial dos transcritos alternativos do gene TPP2. Foi ainda avaliada a eventual patogenicidade de três mutações previamente detectadas no gene SLC10A2. Não foram detectadas quaisquer mutações nem alterações de expressão potencialmente patogénicas nos genes estudados. As análises in silico e de segregação com a doença sugerem no entanto, uma mutação no gene BMPR1A e duas mutações no gene SLC10A2, para as quais são necessários estudos adicionais para concluir sobre a sua patogenecidade. Um dos transcritos do gene TPP2 apresenta expressão diferencial entre amostras, o que sugere a continuação do seu estudo. A LOH frequente em 13q corresponde a ganho/amplificação. Em conclusão, o presente estudo exclui os genes localizados em 21q11, HSPA13 e SAMSN1, e em 13q32-33, TEX30, como possíveis genes candidatos para o FCCTX. Não é ainda possível excluir o gene SLC10A2 nem o gene TPP2. Mutações no BMPR1A deverão ser raras em FCCTX. Parece existir um elevado grau de instabilidade genómica em lesões precoces FCCTX com ganhos/amplificações frequentes

Detection of germline variants with pathogenic potential in 48 patients with familial colorectal cancer by using whole exome sequencing

Background Hereditary genetic mutations causing predisposition to colorectal cancer are accountable for approximately 30% of all colorectal cancer cases. However, only a small fraction of these are high penetrant mutations occurring in DNA mismatch repair genes, causing one of several types of familial colorectal cancer (CRC) syndromes. Most of the mutations are low-penetrant variants, contributing to an increased risk of familial colorectal cancer, and they are often found in additional genes and pathways not previously associated with CRC. The aim of this study was to identify such variants, both high-penetrant and low-penetrant ones. Methods We performed whole exome sequencing on constitutional DNA extracted from blood of 48 patients suspected of familial colorectal cancer and used multiple in silico prediction tools and available literature-based evidence to detect and investigate genetic variants. Results We identified several causative and some potentially causative germline variants in genes known for their association with colorectal cancer. In addition, we identified several variants in genes not typically included in relevant gene panels for colorectal cancer, including CFTR, PABPC1 and TYRO3, which may be associated with an increased risk for cancer. Conclusions Identification of variants in additional genes that potentially can be associated with familial colorectal cancer indicates a larger genetic spectrum of this disease, not limited only to mismatch repair genes. Usage of multiple in silico tools based on different methods and combined through a consensus approach increases the sensitivity of predictions and narrows down a large list of variants to the ones that are most likely to be significant.publishedVersio

Identificação de Novos Genes de Susceptibilidade para o Cancro do Cólon e Recto do Tipo X

O cancro do cólon e recto familiar do tipo X (FCCTX) descreve as famílias HNPCC que preenchem os CA mas não apresentam mutações germinais nos genes MMR e cujos tumores são microssatélites estáveis. Não são ainda conhecidas causas moleculares que expliquem a susceptibilidade para o desenvolvimento de cancro do cólon na grande maioria das famílias FCCTX. Assim, o presente projecto pretendeu identificar genes candidatos/variantes específicas em genes candidatos que possam estar envolvidos na susceptibilidade para o cancro do cólon e recto familiar do tipo X (FCCTX). Foram incluídas neste estudo e foco principal das várias análises, 15 famílias FCCTX. Com base em resultados prévios do grupo e numa possível interacção com o gene MSH6, foi estudada a contribuição de alterações genéticas germinais no gene FBXO11 para a susceptibilidade para o FCCTX, por sequenciação de Sanger, análise de copy-number e de expressão na linha germinal. Para as mesmas famílias foi efectuada uma caracterização a nível germinal de dois subgrupos de famílias FCCTX, correspondentes a duas entidades moleculares previamente identificadas pelo grupo (TSG+ e TSG-), através de sequenciação de nova geração utilizando um painel multigénico de 94 genes que conferem risco aumentado para cancro. Com base nos resultados desta análise foi seleccionado um sub-grupo de genes, que foram analisados para 78 indivíduos índex adicionais de potenciais famílias FCCTX. Para uma família, mais informativa, do grupo TSG-, foi avaliado o potencial carácter patogénico de variantes genéticas específicas em genes candidatos para a susceptibilidade para o FCCTX, obtidas através de whole exome sequencing (WES), de modo a identificar mutações que possam predispor para esta condição hereditária. Com esta finalidade foi efectuada análise bioinformática e análise in silico para selecção de variantes candidatas seguida de análise de segregação com a doença na família em 9 de indivíduos afectados e 3 não afectados. Os resultados obtidos da análise mutacional, de expressão e de copy-number não revelaram qualquer contribuição do gene FBXO11 para o FCCTX. A análise do painel multigénico para as famílias FCCTX identificou mutações em genes que codificam para proteínas associadas a vias de reparação do DNA associadas à recombinação homóloga em 7/17 (47%), mas apenas em famílias com tumores com assinatura molecular TSG+. Mutações nestes genes foram também identificadas num subgrupo de potenciais famílias FCCTX (29/78, 37%), o que poderá vir a ser importante para o manejo clínico destas famílias. A análise das variantes provenientes da sequenciação do exoma numa família FCCTX, permitiu a selecção de 43 variantes, das quais, após completa análise in silico e de segregação, se seleccionaram 6 variantes nos genes MTMR3,DUSP12,LGR6,SMG7,TAS1R1 e NEK7, como contribuindo possivelmente para o FCCTX. A identificação de mais do que uma variante genética em algumas famílias parece estar de acordo com um modelo do FCCTX como uma doença poligénica

Estudo de mutações germinais em genes de suscetibilidade para o cancro do colón e reto familiar do tipo X

O cancro do cólon e reto familiar do tipo X (FCCTX) é um síndrome que define as famílias que preenchem os critérios de Amesterdão, mas cujos tumores não apresentam instabilidade de microssatélites e também nas quais não é identificada mutação germinal nos genes de reparação de erros de DNA do tipo mismatch (MMR). A sua causa molecular permanece desconhecida. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o envolvimento de genes localizados numa região de suscetibilidade previamente identificada para o FCCTX (13q32-33), assim como de mutações identificadas previamente numa família FCCTX, através da análise do exoma por sequenciação de nova geração (NGS). Pretendeuse ainda melhorar a caracterização molecular de tumores FCCTX. Foi efetuada análise de mutações germinais nos genes KDELC1 e ERCC5 em 15 indivíduos índex de famílias FCCTX e 2 familiares de uma dessas famílias. No caso do gene TPP2, foi avaliado o envolvimento de um transcrito expresso alternativamente, previamente identificado, através de análise mutacional e da quantificação da expressão diferencial dos transcritos por real-time PCR. Foi ainda efetuada a análise de segregação com a doença na família, de 5 mutações em genes distintos, selecionadas a partir dos resultados da análise do exoma. Foi efetuada a análise de alterações de copy-number e de metilação nos genes MMR, MGMT e APC em 22 tumores FCCTX por MS-MLPA. Não foram identificadas mutações potencialmente patogénicas nos genes KDELC1 e ERCC5. No entanto, foram identificadas 2 mutações, uma no ERCC5 (c.2636 A>G) e outra no KDELC1 (c.455A>T) em relação às quais não se pode excluir a sua patogenicidade. Não foi detetada qualquer mutação no TPP2 associada à expressão diferencial dos transcritos, no entanto verificou-se que a expressão difere entre tecidos (sangue e cólon). A análise de segregação das mutações selecionadas a partir da análise do exoma, revelou que apenas para um dos genes a alteração poderá ser patogénica. Foram identificados ganhos frequentes, assim como metilação, nos genes MMR e MGMT, nos tumores FCCTX, sendo significativamente mais frequentes num subgrupo destes tumores que apresenta perdas em genes supressores de tumor (TSG+), em relação ao grupo que não apresenta estas alterações. A metilação no APC também apresentou padrões distintos entre os dois subgrupos de tumores FCCTX. Em conclusão, as variantes observadas nos genes KDELC1, ERCC5 e TPP2, assim como a alteração identificada no âmbito da análise do exoma não devem ser excluídas, podendo ser possível a sua contribuição para a suscetibilidade para o FCCTX. O padrão de alterações de copy-number e de metilação nos tumores FCCTX reforça a existência de pelo menos duas entidades moleculares distintas no FCCTX e sugere mecanismos de tumorigénese específicos para a iniciação tumoral neste síndrome

Estudo de novos genes de susceptibilidade para o cancro do cólon e recto familiar

O cancro do cólon e recto familiar do tipo X (FCCTX) define famílias que cumprem os critérios de Amesterdão, não apresentam mutações germinais nos genes de reparação do DNA do tipo mismatch (MMR) e cujos tumores são microssatélites estáveis. Contudo, a sua etiologia genética permanece desconhecida. A identificação de novos genes de susceptibilidade permitirá um diagnóstico precoce com implicações importantes no manejo clínico e tratamento. Num estudo prévio que envolveu a sequenciação do exoma em 5 indivíduos afectados de uma família FCCTX, identificaram-se variantes provavelmente patogénicas nos genes MTMR3, TAS1R1, DUSP12, NPR2, LGR6 com potencial relevância para a tumorigénese coloretal. Assim, este trabalho teve por objetivo estudar o papel destes genes candidatos na susceptibilidade para esta síndrome em famílias FCCTX/FCCTX-like. Pretendeu-se ainda estudar a expressão de um novo transcrito do gene TPP2 com CCR em contexto de FCCTX comparativamente a síndrome de Lynch. Foi realizada uma análise mutacional aos genes candidatos em indivíduos índex de 34 famílias FCCTX/ FCCTX-like, que permitiu identificar 3 variantes provavelmente patogénicas no gene MTMR3 e 2 no gene TAS1R1, nos restantes genes não foram identificadas variantes patogénicas. Para cada gene, estas variantes localizaram-se no mesmo domínio/região funcional. Nenhuma delas foi identificada numa população de controlos saudáveis da população portuguesa, à excepção da variante c.1933C>T (p.Arg645Trp) no gene MTMR3 cuja frequência foi maior em famílias FCCTX (6%), do que na população portuguesa (0,3%). Todos estes factos reforçam o potencial de variantes nestes genes poderem contribuir para a susceptibilidade para o FCCTX. O impacto dessa variante na expressão do MTMR3 e do marcador de autofagia BECN1 foi avaliado por RT-qPCR em lesões do cólon de indivíduos portadores e não portadores da variante. Apesar de não se ter identificado relação entre a presença ou ausência da variante e a expressão do gene, a variante pode ter impacto apenas ao nível da função da proteína. A análise de expressão do novo transcrito do gene TPP2 sugere expressão diferencial entre indivíduos saudáveis, síndrome de Lynch e afectados com CCR/FCCTX. O envolvimento do TPP2 na resposta imunitária sugere que alterações na expressão deste gene possam desempenhar um papel importante na tumorigénese coloretal