Avancées et nouvelles technologies en Toxinologie

Collection Rencontres en Toxinologie ISSN 1760-6004 ; http://sfet.asso.fr/images/stories/SFET/pdf/Ebook-RT18-2010-signets-110322.pdfInternational audienc

Diagnostic MALDI-TOF MS can differentiate between high and low toxic Staphylococcus aureus bacteraemia isolates as a predictor of patient outcome

Staphylococcus aureus bacteraemia (SAB) is a major cause of blood-stream infection (BSI) in both healthcare and community settings. While the underlying comorbidities of a patient significantly contributes to their susceptibility to and outcome following SAB, recent studies show the importance of the level of cytolytic toxin production by the infecting bacterium. In this study we demonstrate that this cytotoxicity can be determined directly from the diagnostic MALDI-TOF mass spectrum generated in a routine diagnostic laboratory. With further development this information could be used to guide the management and improve the outcomes for SAB patients

Genotypic and mass spectrometric comparative analysis of African and German Staphylococcus aureus isolates

Staphylococcus aureus (SA) is a worldwide distributed, opportunistic pathogen colonizing 25-30% of the human population mostly without signs of infections. However, if infections (e.g. wound-, organ infections, sepsis) occurs, those are often associated with a significant morbidity and mortality. SA possesses a broad range of pathogenicity-, virulence- and resistance factors, whose presence is partially associated with specific phylogenetic developmental lines. Thus, the evaluation of transmission of infections is essentially based on phylogenetic analytics. This requires the development of reproducible, highly discriminatory typing methods for distinction of different SA strains. Thus, reproducible, polymerase chain reaction and sequencing based methods such as spa (SA protein A)-typing, multilocus sequencing typing (MLST) up to whole genome sequencing were developed. In contrast to spa-typing which is based on the sequencing of the single gene spa, MLST is based on the sequencing of seven housekeeping genes defining different sequence types (STs) which can be clustered to clonal complexes (CC). STs and CCs are today the grid for the international SA nomenclature in epidemiologic studies. DNA microarrays (MA) represents a special technique in which ST and CC are deduced from characteristic hybridization patterns of numerous genloci which are compared to a database of a large strain collection. In addition to the phylogenetic analysis the DNA MA hold a large number of locis for adhesion, virulence, toxin and resistance genes and thus provide a large amount of data. Comparison of multiple isolates investigated by DMA MA thus, requires supplementary bioinformatic methods for interpretation and presentation. Overall, there are plenty of moleculargenetic based studies of infection epidemiology of SA. But, most of them referred to countries with a high level of microbiological diagnostic. For Africa there is only very limited epidemiological data on SA (inclusive methicillin-resistant SA [MRSA]) especially of non-nosocomial (this means not acquired in hospital) SA (e.g. community-associated (CA) methicillin-resistant or methicillin-susceptible SA [MRSA, MSSA]). In order to fill this knowledge gap, four studies were performed as basis for this doctoral thesis investigating a) different bioinformatic tools for analysis of the molecular epidemiology of SA, b) the epidemiology of African and German MSSA/MRSA originating outside healthcare institutions and c) the applicability of mass spectrometry for analysis of SA epidemiology. For characterization of the bioinformatic tools the subtyping potential of spa-typing versus DNA MA analysis were compared in a study with 46 nasal CA-MSSA and 46 CA-MRSA of infections, collected in the federal state of Saarland. Further, the results were evaluated by three bioinformatic methods (splits graph, hierarchical agglomerative clustering [HAC] and principal component analysis [PCA]). Finally, in order to test the applicability of the DNA MA analytics in the African cohort, a relatively small cohort of isolates of 52 Nigerian MSSA was analyzed by DNA MA and splits graph method. In a big, multicentric, African-German, cross-sectional geographic comparative analysis, 1200 CA-SA isolates of healthy volunteers and patients of Sub-Saharan Africa and Germany were subsequently analyzed by DNA MA. In addition, association and comparative analyses of STs, CCs and gene composition of these isolates with respect to geographic (Germany or Africa) or clinical/nasal origin (nasal/asymptomatic or clinical/invasive) were performed. Finally, the potential applicability of identification of CCs or spa–types of CA-SA of CC5, CC8, CC15, CC30, CC45, CC121 and spa-types t002, t003, t504 based on their MALDI-TOF mass spectrometric profile, were also analyzed. Expected results on the epidemiology of CA-MRSA/MSSA were firstly gained by the DNA MA study of the federal state of Saarland, showing a higher subtyping potential of the DNA MA compared to spa-typing. Evaluation of the DNA MA data by the three previously mentioned bioinformatic methods yielded a diverse assignment of CC5 isolates to 3 to 7 clusters with exception of 12 CC5 isolates that always clustered in two identical clusters. It does not make these methods a failure but the use of different mathematical algorithms analyzing hybridization pattern differences or similarities may lead to minor differences. Further, MSSA displayed a high degree of diversity in comparison to the CA-MRSA group, which was dominated by the CC5 Rhine-Hesse epidemic strain (89%). The further analysis of African MSSA of the study with Nigerian MSSA identified a heterogeneous and divergent nature of the examined Nigerian MSSA and confirmed that the DNA MA is a suitable genotyping method of African SA. The results of the multicentric consortium study showed a total of 40 different CCs and STs, including 5 new STs. The majority, 15 of the 22 (68%) most common CC’s, were either predominant in Sub-Saharan Africa (Gabon, Mozambique, Tanzania) (CC80, CC88, CC121, CC152) or Germany (CC22, CC30, CC45, CC398). The rate of MRSA carriers in the African (3%) and German populations (1%) were very low, probably because the investigation was limited to CA-SA. Analysis of gene profiles identified a high prevalence of the Panton-Valentine leukocidin encoding genes lukF/S-PV in African isolates. Generally, continent-specific differences for the CCs and the CA-SA gene profiles could be identified. Furthermore, it became apparent that in addition to the good first-line characterization by DNA MA, standardized, complex analytical methods for association and epidemiological analyses are required. The last investigation purpose, the evaluation of comparative mass spectra analysis showed that only SA of CC121 were correctly identified based on their mass spectrometric profile on the CC level, while no clear discrimination was achieved for other CCs or spa-types. Taken together, this work identified country specific differences in the distribution of CCs, and specific genes of the examined regions, especially concerning only clinical isolates. The work provide first clues to the genetic based reasons which may explain the purported difference in clinical presentation and course of diseases caused by SA. Additionally, it was shown that DNA MA in contrast to mass spectrometry is a suitable tool for SA characterization e.g. in outbreak situations. However, it should be noted that as specific requirement of a challenging DNA MA based phylogenetic analyses, application of complex bioinformatic analysis methods are required for interpretation of multiple isolates, and that the characteristics and algorithms of the chosen bioinformatic method may result in slight differences in the data interpretation.Staphylococcus aureus (SA) ist ein weltweit verbreitetes, opportunistisches Pathogen, dass 25-30% der Bevölkerung häufig symptomfrei kolonisiert. Treten jedoch invasive Infektionen auf (z.B. Wund-, Organinfektion, Sepsis), so sind diese mit erheblicher Morbidität und Mortalität assoziiert. SA besitzt ein breites Spektrum an Pathogenitäts-, Virulenz- und Resistenzfaktoren, deren Vorhandensein teilweise mit besonderen phylogenetischen Entwicklungslinien assoziiert ist. So basiert die Bewertung von Infektionsübertragung und Ausbruchsgeschehen vielfach auch auf phylogenetischer Analytik. Dies erfordert die Entwicklung reproduzierbarer Typisierungsverfahren, die die unterschiedlichen SA-Stämme auch ausreichend trennscharf charakterisieren können. Daher wurden reproduzierbare, einheitlich auswertbare Polymerasekettenreaktionen und Sequenzierungsmethoden wie spa (SA Protein A)- Typisierung, Multilokussequenztypisierung (MLST), bis hin zur Gesamtgenomsequenzierung entwickelt. Im Gegensatz zur spa-Typisierung, basierend auf der Sequenzierung des einzelnen Gens spa, basiert die MLST auf der Sequenzierung von insgesamt sieben Haushaltsgenen, die verschiedene Sequenztypen (ST) definieren, welche zu klonalen Komplexen (CC) gruppiert werden. STs und CCs bilden heutzutage das Gerüst der internationalen SA Nomenklatur in epidemiologischen Studien. Eine besondere Technik stellen DNA Microarrays (MA) dar, mit deren Hilfe ST und CC aus charakteristischen Hybridisierungsmustern zahlreicher Genloci durch Vergleich mit einer Datenbank einer großen Stammsammlung abgeleitet werden. Neben dieser phylogenetischen Zuordnung besitzt der DNA MA zahlreiche Loci für Adhäsions-, Virulenz- und Toxingene und liefert daher eine große Masse an Daten. Der Vergleich zahlreicher, mittels DNA MA untersuchter, Isolate erfordert daher zur Interpretation und Präsentation ergänzende bioinformatische Methoden. Insgesamt gibt es für SA eine umfangreiche Studienlage zur molekulargenetisch typisierten Infektionsepidemiologie; überwiegend bezieht diese sich jedoch auf Länder mit einem hohen Standard mikrobieller Diagnostik. Für Afrika gibt es nur wenige molekular-epidemiologische Daten von SA (inklusive Methicillin-resistenter SA [MRSA]), insbesondere von nicht nosokomialen (d.h., nicht im Krankenhaus erworbenen) SA (wie z.B. ambulant erworbener (CA) Methicillin-resistenter oder - empfindlicher SA [MRSA, MSSA]). Um diese Wissenslücke zu füllen, wurden als Grundlage dieser Promotionsarbeit vier Studien durchgeführt zur Untersuchung a) verschiedener bioinformatischer Werkzeuge zur Analyse der molekularen Epidemiologie von SA, b) der Epidemiologie von afrikanischen und deutschen CAMSSA/ MRSA, die nicht in Gesundheitsinstitutionen erworben wurden, und c) der Anwendbarkeit der Massenspektrometrie zur Analyse der Epidemiologie von SA. Zur Charakterisierung der bioinformatischen Werkzeuge wurde das Subtypisierungspotential der spa-Typisierung und der DNA MA Analyse in einer Studie mit 46 nasalen CA-MSSA und 46 von Infektionen stammenden CA-MRSA des Bundeslandes Saarland verglichen. Zudem wurden die Ergebnisse mit drei bioinformatischen Methoden („splits graph“, hierarchische agglomerative Gruppierung [HAC] und Hauptkomponentenanalyse [PCA]) zur DNA Analyse evaluiert. Um die Anwendbarkeit der DNA MA Analytik auch in afrikanischen Kohorten zu überprüfen, wurde eine relativ kleine Isolatkohorte von 52 nigerianischen MSSA Isolaten mittels DNA MA und splits graph Analyse untersucht. In einer großen, multizentrischen, afrikanisch-deutschen, geographisch vergleichenden Querschnittsuntersuchung wurden 1200 CA-SA Isolate, gesunder Freiwilliger und von Patienten aus Sub-Sahara Afrika und Deutschland, mittels DNA MA analysiert. Zudem wurden Assoziations- und vergleichende Analysen der CC, ST und der Genausstattung der Isolate, hinsichtlich ihrer geographischen Herkunft (Deutschland oder Afrika) bzw. ihres klinischen/kommensalen Ursprung, durchgeführt. Schließlich wurde die mögliche Anwendbarkeit der Identifikation von CCs oder spa–Typen von CA-SA des CC5, CC8, CC15, CC30, CC45, CC121 und der spa- Typen t002, t003, t504 basierend auf MALDITOF Massenspektrometrieprofilen analysiert. Die mit diesen Untersuchungen angestrebten Ergebnisse, zur Epidemiologie von CAMSSA/ MRSA, wurden zunächst mit der DNA MA Studie des Bundeslandes Saarland gewonnen, welche ein höheres Subtypisierungspotential für den DNA MA im Vergleich zur spa–Typisierung zeigte. Die Auswertung der DNA MA Daten mittels der zuvor genannten drei bioinformatischen Methoden zeigte eine unterschiedliche Zuordnung von CC5 Isolaten zu 3 bis 7 Isolatgruppen mit Ausnahme von zwölf CC5 Isolaten. Diese zwölf CC5 Isolate wurden immer zwei identischen Isolatgruppen zugeordnet. Dies heißt nicht, dass die Methoden fehlerhaft sind, sondern dass die Anwendung unterschiedlicher mathematischen Algorithmen, die entweder die Unterschiede oder die Ähnlichkeiten der Hybridisierungsmuster untersuchen, zu geringfügigen Unterschieden führen. Zudem zeigten die MSSA eine hohe Diversität im Vergleich zur CA-MRSA Gruppe, die vom CC5 Rhine-Hesse epidemischen Stamm dominiert wurde (89%). Die weitere Analyse afrikanischer Stämme aus der Studie mit nigerianischen MSSA zeigte eine heterogene und divergente Natur der untersuchten nigerianischen MSSA und bestätigte, dass der DNA MA eine geeignete Methode zur Genotypisierung afrikanischer SA ist. Die Ergebnisse der multizentrischen deutsch-afrikanischen Konsortialstudie wies innerhalb der Isolatgruppe insgesamt 40 verschiedene CCs und STs nach, einschließlich 5 neuer STs. Die Mehrheit, 15 von 22 (68%) der CCs, die auch am häufigsten identifiziert wurden, waren entweder in Sub-Sahara Afrika (Gabon, Mozambique, Tanzania) (CC80, CC88, CC121, CC152) oder Deutschland (CC22, CC30, CC45, CC398) vorherrschend. Die Rate an MRSA Trägern in der afrikanischen (3%) und deutschen Bevölkerung (1%) war sehr gering, vermutlich durch die auf CASA beschränkte Untersuchung. Die Analyse der Genprofile zeigte eine hohe Prävalenz der Panton-Valentin Leukozidin kodierenden Gene lukF/S-PV in afrikanischen Isolaten. Allgemein konnten kontinentspezifische Unterschiede für die CC und CA-SA Genprofile identifiziert werden. Zudem wurde ersichtlich, dass ergänzend zur guten Erstcharakterisierung durch den DNA MA, standardisierte, komplexe analytische Methoden für Assoziationsanalysen und epidemiologische Untersuchungen erforderlich sind. Das letzte Untersuchungsziel, die Bewertung vergleichender Massenspektrometrieanalysen zeigte, dass - basierend auf ihrem Spektrometrieprofil - nur SA des CC121 korrekt identifiziert werden konnten, während keine korrekte Identifikation anderer CC oder spa-Typen möglich war. Zusammenfassend identifizierte diese Arbeit länderspezifische Unterschiede in der Verteilung klonaler Komplexe und spezifischer Gene in den untersuchten Regionen, insbesondere bei alleiniger Betrachtung klinischer Isolate. Sie gibt wertvolle Hinweise auf die genetisch basierten Gründe, welche die angeblichen Unterschiede in der klinischen Präsentation und dem Verlauf von durch SA verursachten Infektionen in sich entwickelnden und industriellen Ländern erklären könnten. Zudem wurde gezeigt, dass der DNA MA im Gegensatz zur Massenspektrometrie eine geeignete Methode zur SA Charakterisierung z.B. in Ausbruchssituationen ist. Es darf jedoch nicht unerwähnt bleiben, dass als besondere Anforderung an eine anspruchsvolle, DNA MA-basierte phylogenetische Analytik mehrerer Isolate die Anwendung komplexer bioinformatischer Analysemethoden zur Interpretation erforderlich ist, und dass die Charakteristiken und Algorithmen der gewählten bioinformatischen Methode zu geringfügigen Unterschieden in der Dateninterpretation führen kann

Application of MALDI Mass-Spectrometry for Diagnostics of Particularly Dangerous Infectious Diseases: Current State of Affairs and Prospects

Mass spectrometry is a modern physical-chemical analytical method that provides for qualitative and quantitative assessment of the substance composition. It is based on pre-ionization of the atoms and molecules included into it. One of the advanced methods of ionization, due to which mass-spectrometry investigation of macromolecules has become a frequent practice, is matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI). The essence of it is the pulsed laser irradiation of the matter under study, mixed with the matrix. The review discusses current data on MALDI mass-spectrometry application for the performance of species-specific and genus-specific identification of microorganisms at the premises of diagnostic laboratories. Considered are the basic advantages of MALDI-TOF identification as compared to bacteriologic, immunologic, and molecular-genetic methods of assessment. Allocated is the mass-spectrometry position in the system of laboratory diagnostics of infectious diseases, including particularly dangerous ones, in the territory of the Russian Federation

Alimentación universitaria: aspectos nutricionales, microbiológicos y toxicológicos

En las últimas décadas la restauración colectiva universitaria ha adquirido gran importancia. Es importante garantizar la calidad y variedad de los menús desde un aspecto nutricional como microbiológico o toxicológico. El control del nivel de compuestos polares en aceites y grasas usados es una medida de prevención frente a tóxicos de origen químico. El estudio de la prevalencia de Anisakis simplex en muestras de pescado es una medida para garantizar la seguridad alimentaria. Los servicios de restauración deben cumplir determinadas normas de higiene para la elaboración, distribución y comercio de comidas preparadas con la finalidad de mantener una calidad microbiológica adecuada. El riesgo producido por la presencia de microorganismos en los alimentos no viene representado únicamente por las bacterias presentes sino, también por las toxinas bacterianas. Entre ellas merecen especial atención las de E. coli y S. aureus. E. coli es una bacteria frecuentemente asociada con toxiinfecciones e intoxicaciones alimentarias. En condiciones normales, constituye una parte esencial de la flora bacteriana humana, sin embargo, existen cepas capaces de provocar alteraciones graves en forma de enteritis. Este grupo de cepas se denomina E. coli enterotoxigénico (ETEC) y se transmiten a través de los alimentos o el agua contaminada por heces animales o humanas. La toxina termo-lábil (HLT) es su principal factor de virulencia. S. aureus es la bacteria enterotoxigénica más corriente de los alimentos. Las cepas toxigénicas de S. aureus pueden producir más de una enterotoxina aunque la enterotoxina del tipo A es la que con más frecuencia aparece en los brotes de intoxicación alimentaria, seguida de los tipos B y D. Merece especial atención la toxina 1 del síndrome del shock tóxico (TSST-1). El desarrollo de técnicas rápidas y selectivas para la identificación y cuantificación de toxinas bacterianas contribuirá a garantizar la seguridad alimentaria.The catering service at university has become very important in all developed countries in recent decades. Consumers are increasingly demanding healthy and safe food, with better nutritional properties. Meals served must ensure the nutritional quality and limit the exposure to different contaminants that can be found in food. It is therefore important to ensure the quality and variety of menus offered daily, from a nutritional viewpoint as microbiological or toxicological. University students have a special interest because many of them assume, for the first time, responsibility for their meal. Dietary habits established by university students when they are away from home, can have a significant effect on their health, determining or modifying the risk of nutrition-related diseases. In addition to the nutritional hazards it is desirable to identify, assess and prevent hazards from physical, chemical or biological origin that can affect food safety, in order to implement appropriate measures to reduce or eliminate hazards to acceptable health standards. University restaurants are catering services, where transformation of food is done to serve customers. The food served must have adequate sanitary and organoleptic quality, it is also important to safeguard the safety, as these foods may be responsible for food poisoning. Monitoring of polar compounds (legislated in Spain) in oils and fats used is a preventive measure against toxic chemical hazards. These are compounds formed in used oils as a result of changes in fats and oils during frying processes. The presence of external substances with biological origin in foods can also be cause of foodborne disease (FBD). Products consumed in university establishments can be vectors of several biological contaminants, mainly parasites and bacteria. It is therefore important to have systematic monitoring of the microbiological quality of the food served. A large number of marine and freshwater fish can serve as a source of medically important parasitic zoonoses. The most important of the fish-borne helminthes are anisakid nematodes (particularly Anisakis simplex). On the other hand, restaurants must meet certain hygiene standards for production, distribution and trade of ready meals in order to assess the quality and microbiological safety of food. The toxicological hazard caused by the presence of microorganisms in food is not represented only by bacteria present in food; but also bacterial toxins in foods eaten are important. Among them deserve particular attention for E. coli and S. aureus toxins. E. coli is a bacteria often associated with outbreaks and food poisoning. Under normal conditions, constitutes an essential part of human bacterial flora, however, there are strains capable of causing serious diseases as enteritis. This group of strains is called enterotoxigenic E. coli (ETEC) and is transmitted through food or contaminated water by animal or human feces. ETEC labile toxin (LT) is the major virulence factor of ETEC. S. aureus is the most common toxigenic bacteria in food. It is responsible for most annual cases of food poisoning caused by ingestion of foods where enterotoxins have been preformed. Toxigenic strains of S. aureus can produce more than one enterotoxin although enterotoxin type A is the most frequently found in outbreaks, followed by types B and D. S. aureus produce also toxic shock syndrome toxin 1 (TSST-1), previously classified as enterotoxin F, which has not been extensively studied in restaurants. The development of rapid and effective techniques for enterotoxin isolation and identification represent a great advantage for the evaluation of its toxicity and to quantify the amount of toxin produced by strains isolated from food. This will contribute to food security and thereby safeguard consumers´ health in university restaurants

Fatores de patogenicidade, perfil de resistência a antimicrobianos e diversidade clonal de Staphylococcus aureus isolados de leite cru, soro fermento, manipuladores e queijo Minas artesanal da região de Campo das Vertentes, Brasil

Staphylococcus aureus is one of the main pathogens found in cheeses produced with raw milk, including Minas artisanal cheese from Brazil. However, information on S. aureus isolated from artisanal cheeses and its sources of production in small-scale dairies is very limited. We aimed to characterize the virulence aspects and clonal diversity of S. aureus isolated from Minas artisanal cheese, raw milk, endogenous starter culture and handlers from the region of Campo das Vertentes, Minas Gerais State, Brazil. The samples were identified by MALDI-TOF MS. Biofilm production was evaluated on Congo Red Agar (CRA) and polystyrene plates. PCR was used to detect icaA, icaB, icaC, sea, seb, sec, sed, see, tsst-1, agr and mecA. Expression of staphylococcal toxin genes in PCR positive samples was evaluated by qRT-PCR and the production of these toxins as well as hemolytic activity were in vitro evaluated. We also evaluated the antimicrobial resistance profile of the samples. For statistical analysis, cluster, chi-square test and correspondence were used. The study of the clonal diversity of the samples was performed by the spa typing, rep-PCR ((GTG)5) and MALDI-TOF MS techniques. The discriminatory power, the typability and the concordance between the typing techniques were evaluated. A total of 76 Staphylococcus aureus samples were analyzed. In the PCR, 18.42%, 18.42%, 2.63% and 77.63% of the samples were positive for sea, tsst-1, sec and agr, respectively. Staphylococcal toxin genes were of low expression in qRT-PCR and only two samples were TSST-producing. Most of the samples (61.84%) had hemolytic activity and were biofilm forming in CRA (69.73%) and in polystyrene plates (81.58%). None of the samples presented mecA neither presented a multiresistance pattern, with the highest resistance observed for Penicillin G (67.11%) and Tetracycline (27.63%). The most frequent genotype in the study was t605 (27%), followed by t002 (10.8%) and t521 (9.5%). Spa typing and (GTG)5 presented high discriminatory power, in contrast to MALDI-TOF MS, which presented low discriminatory power and low concordance with typification genomic techniques. In conclusion, the samples presented toxigenic potential, with a higher prevalence of sea and tsst-1. We found that the biofilm production was the main virulence factor of the samples. Six clusters were formed whose distribution frequencies differed 13 for hemolytic activity, biofilm formation (qualitative and quantitative analyses) and resistance to Penicillin, Tetracillin and Erythromycin (P <0.05). Staphylococcus aureus samples showed high genetic diversity, and there are evidences that the presence of this microorganism in the final product is the result of cross-contamination of raw milk, serum-yeast (pingo) and asymptomatic manipulators of this bacterial agent. These findings emphasize the need for effective measures to prevent staphylococcal food poisoning by limiting S. aureus growth and enterotoxin formation, , as well as reinforcing the importance of implementing good manufacturing practices to reduce the risk of transmission of potentially pathogenic bacteria along the cheesemaking chain.Staphylococcus aureus é um dos principais agentes patogênicos encontrados em queijos produzidos com leite cru no mundo, incluindo o queijo Minas artesanal produzido no Brasil. No entanto, informações sobre S. aureus isolados de queijos artesanais e de fontes de produção em queijarias de pequena escala são muito limitadas. Nós objetivamos caracterizar os aspectos de patogenicidade e a diversidade clonal de S. aureus isolados de queijo Minas artesanal, leite cru, soro-fermento e manipuladores da Região de Campo das Vertentes, MG, Brasil. As amostras foram identificadas usando MALDI-TOF MS e para a avaliação de produção de biofilme o Agar Vermelho Congo (AVC) e placas de poliestireno. PCR foi utilizada para detectar icaA, icaB, icaC, sea, seb, sec, sed, see, tsst-1, agr e mecA. A expressão dos genes das toxinas estafilocócicas em amostras positivas na PCR foi avaliada por qRT-PCR e a produção dessas toxinas bem como a atividade hemolítica foram avaliadas in vitro. Também avaliamos o perfil de resistência antimicrobiana das amostras. Para análises estatísticas foram utilizados cluster, teste qui-quadrado e correspondência. O estudo da diversidade clonal das amostras foi realizado pela aplicação das técnicas de spa typing, rep-PCR ((GTG)5) e MALDI-TOF MS, sendo realizada a avaliação do poder discriminatório, da tipabilidade e da concordância entre as técnicas de tipificação supramencionadas. Foram analisadas 76 amostras de Staphylococcus aureus. Na PCR, 18,42%, 18,42%, 2,63% e 77,63% das amostras foram positivos para sea, tsst-1, sec e agr, respectivamente. Os genes das toxinas estafilocócicas foram de baixa expressão na qRT-PCR e apenas duas amostras foram produtoras de TSST. A maior parte das amostras (61,84%) apresentou atividade hemolítica e foram formadoras de biofilme em CRA (69,73%) e em placas de poliestireno (81,58%). Nenhuma das amostras possuia mecA nem apresentou padrão de multirresistência, sendo as maiores resistências observadas para Penicilina G (67,11%) e Tetraciclina (27,63%). O genótipo de maior frequência no estudo foi o t605 (27%), seguido pelos tipos t002 (10,8%) e t521 (9,5%). Spa typing e (GTG)5 apresentaram alto poder discriminatório, em contrapartida ao MALDI-TOF MS que apresentou baixo poder discriminatório e baixa concordância com as técnicas genômicas de tipificação. Em conclusão, as amostras apresentaram potencial toxigênico, com maior prevalência de sea e tsst-1. Nós constatamos que a produção de biofilme foi o principal fator de patogenicidade das amostras. Foram formados seis clusters cujas frequências de distribuição diferiram para atividade hemolítica, formação de biofilme (análises qualitativa e quantitativa) e resistência à Penicilina, Tetracilina e Eritromicina (P<0,05). As amostras de Staphylococcus aureus apresentaram alta diversidade genética, e há indícios de que a presença desse micro-organismo no produto final seja fruto da contaminação cruzada do leite cru, do soro-fermento (pingo) e dos manipuladores assintomáticos desse agente bacteriano. Nossos achados enfatizam a necessidade de medidas efetivas que previnam a intoxicação alimentar estafilocócica, limitando o crescimento de S. aureus e a formação de enterotoxinas, bem como reforçam a importância da implementação das boas práticas de fabricação para reduzir o risco de transmissão de bactérias potencialmente patogênicas ao longo da cadeia de produção do queijo Minas artesanal.CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic

Massenspektrometrische Untersuchung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus ist ein weitverbreiteter Keim und der bedeutendste Verursacher nosokomialer Infektionen. Zur Prävention von MRSA-Ausbrüchen ist ein gutes Diagnostikkonzept erforderlich. Es gibt verschiedene Ansätze (WGS, spa-Typisierung und MALDI-TOF), die sich in Kosten, Schnelligkeit, Sensitivität und Aufwand unterscheiden. Um MALDI-TOF für diesen Zweck einsetzen zu können ist es essenziell, mit dieser Methode unterschiedliche Isolate, möglichst auf Subklonebene voneinander unterscheiden zu können. Diese Arbeit untersucht in einem vorgegeben Versuchskollektiv von S. aureus der klonalen Linie CC5, ob Unterschiede signifikant und reproduzierbar mittels Massenspektrometrie herauszuarbeiten sind. Es erfolgten Messreihen mit biologischen und technischen Replikaten und eine Auswertung der Spektren mittels Clusteranalyse/Visualisierung unter Verwendung der BIONUMERICS Software. Zur Auswertung wurden Kompositspektren der einzelnen Komponentenspektren berechnet. In der Visualisierung mittels t-SNE sowie Ähnlichkeitsmatrix mit BIONUMERICS ließ sich kein Cluster nach spa-Typ oder mec-Klasse abgrenzen. Das Versuchskollektiv wurde in Gruppen unterteilt, die sich in spa-Typ und mec-Klasse unterschieden. Ziel dieser Aufteilung war die Bestimmung signifikanter Peaks als mögliche Biomarker für ähnliche Isolate. So gelang es die Peaks 3445, 6354 und 6890 jeweils +/-5 m/z signifikant in der Gruppe der Isolate mit spa-Typ t002 und mec-Klasse II zu identifizieren. Die Peaks 4345, 6927 und 4307 jeweils +/-5 m/z waren signifikant in der Gruppe der Isolate mit spa-Typ t002 und mec-Klasse IV und können somit als mögliche Biomarker zur Diskrimination herangezogen werden. Eine Einschränkung der Leistungsfähigkeit dieser potentiellen Biomarker ist die geringe Sensitivität bzw. Spezifität. Für spa-Typ t003 konnte der Peak m/z 7568 mit einer Sensitivität von 38,1% und einer Spezifität von 81,3% und der Peak m/z 3178 mit einer Sensitivität von 50% und einer Spezifität von 82,1% als möglicher Biomarker identifiziert werden. Eine signifikante Unterscheidung aller Isolate konnte diese Arbeit nicht zeigen. Aufgrund der hohen Verwandtheit und Ähnlichkeit der Isolate (alle CC5), die in der klinischen Anwendung aber realistisch ist, muss zur Identifikation eine weitere Trennmethode eingesetzt werden. Das Ziel, eine ausreichend genaue Analysemethode zu entwickeln, konnte aus o.g. Gründen nicht realisiert werden. Die im Rahmen der messtechnischen Arbeiten gewonnenen Erkenntnisse über Fehlerquellen und Einflussfaktoren sind jedoch für weitere Schritte zur Definition eines erforderlichen Analysestandards nutzbar. Wesentlich war hierfür die systematische Isolation von Ausreißern unter Anwendung der Kompositspektren, die dem bekannten Nachteil der MALDI-TOF Massenspektrometrie - der begrenzten Reproduzierbarkeit - entgegen wirken. Neue vielversprechende Forschungsansätze kombinieren Spektren des MALDI-TOF mit Methoden des Maschinellen Lernen (Machine Learning). Hierfür wird jedoch eine deutliche größere Datenmenge zum Anlernen und Validieren der Methode benötigt

Detection and quantification of staphylococcus aureus enterotoxin B in food product using isotopic dilution techniques and mass spectrometry

L’entérotoxine B staphylococcique (SEB) est une toxine entérique hautement résistante à la chaleur et est responsable de plus de 50 % des cas d’intoxication d’origine alimentaire par une entérotoxine. L’objectif principal de ce projet de maîtrise est de développer et valider une méthode basée sur des nouvelles stratégies analytiques permettant la détection et la quantification de SEB dans les matrices alimentaires. Une carte de peptides tryptiques a été produite et 3 peptides tryptiques spécifiques ont été sélectionnés pour servir de peptides témoins à partir des 9 fragments protéolytiques identifiés (couverture de 35 % de la séquence). L’anhydride acétique et la forme deutérée furent utilisés afin de synthétiser des peptides standards marqués avec un isotope léger et lourd. La combinaison de mélanges des deux isotopes à des concentrations molaires différentes fut utilisée afin d’établir la linéarité et les résultats ont démontré que les mesures faites par dilution isotopique combinée au CL-SM/SM respectaient les critères généralement reconnus d’épreuves biologiques avec des valeurs de pente près de 1, des valeurs de R2 supérieure à 0,98 et des coefficients de variation (CV%) inférieurs à 8 %. La précision et l’exactitude de la méthode ont été évaluées à l’aide d’échantillons d’homogénat de viande de poulet dans lesquels SEB a été introduite. SEB a été enrichie à 0,2, 1 et 2 pmol/g. Les résultats analytiques révèlent que la méthode procure une plage d’exactitude de 84,9 à 91,1 %. Dans l’ensemble, les résultats présentés dans ce mémoire démontrent que les méthodes protéomiques peuvent être utilisées efficacement pour détecter et quantifier SEB dans les matrices alimentaires. Mots clés : spectrométrie de masse; marquage isotopique; protéomique quantitative; entérotoxinesStaphylococcal enterotoxin B is a highly heat-resistant enteric toxin and it is responsible for over 50% of enterotoxin food poisoning. It represents a particular challenge during food processing since, even if the bacteria have been destroyed, the biological activity of the toxin remains unchanged. The objective of this study was to develop and validate a new method based on a novel proteomic strategy to detect and quantify SEB in food matrices. Tryptic peptide map was generated and 3 specific tryptic peptides were selected and used as surrogate peptides from 9 identified proteolytic fragments (sequence coverage of 35%). Peptides were label with light and heavy form of acetic anhydride to create an isobaric tag that will allow quantification. The linearity was tested using mixtures of different molar ratios and the results showed that measurements by LC-MS/MS were within generally accepted criteria for bioassays with slope values near to 1, values of R2 above 0.98 and less than 8% coefficient of variation (%CV). The precision and accuracy of the method were assessed using chicken meat homogenate samples spiked with SEB at 0.2, 1 and 2 pmol/g. The results indicated that the method can provide accuracy within 84.9 – 91.1% range. Overall, the results presented in this thesis show that proteomics-based methods can be effectively used to detect, confirm and quantify SEB in food matrices. Keywords: mass spectrometry; stable isotope labeling; quantitative proteomics; enterotoxin