Vergleich der genetischen und biochemisch-phänotypischen Eigenschaften von ausgewählten Stämmen der fakultativ pathogenen Spezies Actinobacillus actinomycetemcomitans

Der fakulativ pathogene Mikroorganismus Actinobacillus actinomycetemcomitans gehört zur physiologischen Mundhöhlenflora des Menschen und anderer Säugetiere, wobei er sowohl in der Mundhöhle parodontal Gesunder als auch in der Mundhöhle parodontal Erkrankter vorkommt. Aufgrund seiner zahlreichen Pathogenitätsmechanismen ist er imstande, destruktive parodontale Krankheiten zu initiieren. Er wird in hohen Raten in den Parodontalläsionen von Patienten nachgewiesen, die an lokalisierter juveniler Parodontitis (LJP = alte Nomenklatur), auch lokalisierte aggressive Parodontis (LAP = neue Nomenklatur, 1997), erkrankt sind. Zudem wird ihm eine Rolle bei der Pathogenese der Endokarditis, Sepsis, Sinusitis, chronische Bronchitis, Pneumonie, Osteomyelitis und bei Harnwegsinfektionen, sowie Kiefer-, Schilddrüsen-, Haut- und Gehirnabszessen zugeschrieben. Actinobacillus actinomycetemcomitans stellt hohe Ansprüche an die Kulturbedingungen und ist deshalb nicht immer leicht zu diagnostizieren. Es handelt sich hierbei um ein kleines unbewegliches, nicht sporenbildendes, gramnegatives, kokkoides Stäbchen, welches zudem als fakultativ anaerob, mikroaerophil und capnophil gilt. Um die Frage nach einer prädiktiven Aussage zur Virulenz/Pathogenität von Actinobacillus actinomycetemcomitans mittels genomischer Marker bereits in der mikrobiologischen Diagnostik zu beantworten, wurden 34 Stämme der Stammsammlung des Instituts für medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene, Marburg untersucht. Diese wurden mit zwei unterschiedlichen molekularbiologischen Methoden und einer klassischen phänotypischen Charakterisierung analysiert. Weder die Untersuchung mit Hilfe der DNA-DNA Hybridisierung nach der optischen Renaturierungsmethode noch die Ergebnisse der DNA-Sequenzierung spiegelten jedoch die Unterschiede der von den jeweiligen Stämmen hervorgerufenen chronischen und akuten Infektionen wider. Ebenso erfolgte die Bestimmung biochemischer Eigenschaften mit Hilfe der Bunten Reihe und zwei verschiedenen kommerziellen Schnelltestsystemen mit dem Ziel herauszufinden, ob phänotypische Eigenschaften für taxonomische Untersuchungen verläßliche Marker darstellen und ob gegebenenfalls bestimmte Merkmale und Merkmalskombinationen Hinweise auf das Pathogenitätspotential einzelner Isolate geben können. Die phänotypischen Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen der Genomuntersuchung verglichen. Auch hier kam es zu widersprüchlichen Resultaten, da sich die Unterschiede innerhalb der biochemischen Versuchsreihe nicht durch genomische Ergebnisse belegen ließen. Im Unterschied zu den DNA-DNA Hybridisierungsergebnissen ließen sich die Vergleichswerte der DNA-Sequenzen über eine taxometrische Auswertung im "single-linkage-clustering" als Ähnlichkeits-Dendrogramm darstellen, das die verschiedenen phänotypischen Gruppen in unterschiedlichen Ästen aufführte. Die verschiedenen biochemischen Entitäten von Actinobacillus actinomyctemcomitans konnten somit über das Verfahren der Sequenzierung teilweise reflektiert werden. Es ergaben sich unterschiedliche genetische Gruppen, die sich jedoch anders als die Gruppen phänotypischer Reaktionsmuster zueinander verhielten. Zudem wurde die Verläßlichkeit der Identifizierung der 34 untersuchten Actinobacillus actinomycetemcomitans Stämme anhand der Schnelltestsysteme überprüft, die sich bei beiden Systemen als unzureichend erwies. Biochemische Gruppen der Spezies Actinobacillus actinomycetemcomitans sind durch Sequenzierung identifizierbar; unterschiedlich virulente Stämme lassen sich über keine der hier geprüften Methoden erkennen. In der Diagnostik sind daher möglicherweise weiterhin noch zusätzliche serologische Verfahren notwendig, solange noch kein sicherer Nachweis von Virulenzgenen routinemäßig möglich ist

Der Griff nach den Genen

Der Artikel versucht nachzuzeichnen, wie sich nach der Entdeckung von Gesetzmäßigkeiten in der Vererbung durch Gregor Mendel die Wissenschaftliche Genetik seit etwa Mitte des 19. Jahrhunderts weiter entwickelt und seit Mitte des vorigen Jahrhunderts in immer schnelleren Schritten zu revolutionierenden Entdeckungen, Techniken und Einsichten geführt hat. Heute erlauben uns diese Erkenntnisse, individuelle Gene in Substanz zu isolieren und zu manipulieren, so dass wir bereits beträchtliche Einblicke in die Erbinformationen zahlreicher Organismen auf molekularer Ebene besitzen. Unausweichlich waren in dieser Entwicklung Abwägungen über den Nutzen gegenüber den Risiken, die der erreichte Kenntnisstand und die jetzigen Möglichkeiten der Gentechnik (oder Biotechnik) mit sich bringen

Funktionelle Untersuchung von genetischen Faktoren mit prognostischer Relevanz in der Onkologie

Lungenkarzinome sind im Vergleich zu anderen Krebsarten die häufigste Todesursache weltweit. Aufgrund der späten Diagnose und einer hohen Rate an Therapieresistenzen liegt die 5-Jahres-Überlebensraten bei nur 13% und ist damit eine der niedrigsten überhaupt. Die Identifikation von potentiellen Biomarkern für eine Verbesserung der Therapieansätze rückt dabei zunehmend in den Vordergrund. Epigenetische Veränderungen spielen bei der Progression von Tumoren eine elementare Rolle, wobei diese mit der Karzinogenese und der Ausprägung einer Therapiereistenz in Verbindung stehen. Epigenetische Modifikatoren wie die H3K4-Methyltransferase KMT2D und das Chromatin-Bindeprotein (Reader) BRD4 sind häufig in verschiedenen Krebsarten wie z.B. in NSCLC mutiert. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollten in verschiedenen Lungenkrebszelllinien unter Verwendung von CRISPR CAS9 definierte Mutationen in den Kandidatengenen KMT2D und BRD4 induziert werden, um funktionelle Mechanismen eingehender zu untersuchen, die mit einer Tumorprogression assoziiert werden. Die Deletionen im Kandidatengen KMT2D unterscheiden sich dadurch, dass bei einer der Deletionen ein Verlust der SET-Domäne erfolgt (Zelllinie B6), wohingegen bei der anderen Deletion das Leseraster C-terminal und damit auch die SET-Domäne erhalten bleibt (Zelllinie A76). In BRD4 wird eine Deletion des gesamten Gens eingefügt. In ChIP-Seq –Analysen der Parental-Zelllinien erfolgte zunächst die Identifikation spezifisch angereicherter Signalwege, die in Prozessen der zellulären Stressantwort, dem Spleißprozess und der epigenetischen Regulation eine Rolle spielten. Zudem konnte eine starke Anreicherung im EGFR-Signalweg festgestellt werden. Um die mögliche Auswirkung der induzierten Mutationen in diesen identifizierten Signalwegen eingehender zu betrachten, wurden diese in Expressions-, Proliferations- und methylierungsspezifischen Experimenten analysiert. Des Weiteren wurde der Einfluss von KMT2D auf eine epigenetisch bedingte Therapieresistenz gegen die EGFR-wirkenden Chemotherapeutika Cetuximab und Erlotinib untersucht. Die induzierten Mutationen führten zu einer verminderten RNA- und Proteinexpression der Kandidatengene. Bei der KMT2D-Zelllinie A76 konnten deutliche morphologische Veränderungen beobachtet werden. Die Zellproliferation war in der Analyse verglichen zur Parental-Zelllinie HCC827 deutlich in den KMT2D-mutierten Zelllinien vermindert. In den Western Blot Analysen führten die induzierten KMT2D- und BRD4-Mutationen zu Veränderung der gesamten Histon-Mengen, die sich in einer differenziellen H3K4- und H3K27-Methylierung in den mutierten Zelllinien widerspiegelten. Durch einen Hitzestress konnte eine Stabilisierung der methylierten Histon-Mengen beobachtet werden. Zudem wurden Unterschiede in der Zellviabilität nach der Induktion durch einen Hitzestress ermittelt. In den BRD4-mutierten Zelllinien konnten hingegen keine Unterschiede in der Zellviabilität nach einem Hitzeschock im Vergleich zur parentalen Zelllinie Wi38 festgestellt werden. Die KMT2D-Mutationen resultierten in einer veränderten RNA-Expression von H3K4- und H3K27-relevanter Methyltransferasen und Demethylasen. Zudem konnten Veränderungen in der Expressionsanalyse von U2 snRNP Spleiß-Faktoren in den KMT2D- und BRD4-mutierten Zelllinien festgestellt werden. Bei der KMT2D-Mutante A76 konnte zudem in Zellviabilitätsassays eine erhöhte Sensitivität gegenüber Cetuximab und Erlotinib beobachtet werden

Die Genetik des Lipidstoffwechsels als Risikofaktor für kognitive Defizite bei der Parkinson-Krankheit

Die Parkinson-Krankheit gehört zu den Basalganglienerkrankungen und ist nach der Alzheimer-Krankheit die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung. Von den typischen motorischen Leitsymptomen sind kognitive Defizite, auch Parkinson-Demenz genannt, abzugrenzen. Etwa 75% der Parkinson-Syndrome sind idiopathisch und treten sporadisch auf. Bei dieser großen Mehrheit der Erkrankten gibt es bislang kein identifizierbares Vererbungsmuster. Für eine intakte Hirnfunktion ist der zerebrale Cholesterinmetabolismus von hoher Bedeutung, sodass kodierende Gene des Cholesterinstoffwechsels in die Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere der Alzheimer-Krankheit, involviert sind. Ausgehend von der bekannten pathophysiologischen Überschneidung der Alzheimer- und Parkinson-Krankheit, dient diese Arbeit einer systematischen Untersuchung ausgewählter Gene des Lipidstoffwechsels im Zusammenhang mit der Parkinson-Demenz. Das Kollektiv aus 94 Parkinson-Erkrankten entstammte der Datenbank der longitudinalen LANDSCAPE Studie, wobei 2 Gruppen von Parkinson-Patienten mit Demenz und unbeeinträchtigter Kognition gebildet wurden. Im Vorfeld wurde ein Matching zwecks höherer Vergleichbarkeit der Fall- und Kontrollgruppe anhand der Kriterien Geschlecht, ≥ 6 Jahre Erkrankungsdauer und ± 7 Jahre Altersdifferenz durchgeführt. Als Ausgangsmaterial der laborchemischen Versuche lag isolierte Desoxyribonukleinsäure vor, wobei mittels Polymerase-Kettenreaktion bestimmte Gen-Loci zwecks weiterer Aufschlüsselung amplifiziert wurden. Im Sinne eines genetischen Screenings wurden alle kodierenden Abschnitte der Apolipoproteine E, A1 und J sequenziert, wobei es sich um etablierte Risikogene der Alzheimer-Krankheit handelt. Zusätzlich wurden ausgewählte Exone von Adenosine Triphosphate-binding Cassette Transporter A1 (Exon 7, 18, 35) und Very-Low-Density-Lipoprotein Receptor (Exon 15) untersucht, bei denen bereits im Vorfeld kritische Mutationen beschrieben wurden. Im Fokus stand dabei die Identifikation von Einzelnukleotid-Polymorphismen, die möglicherweise mit der Ausprägung einer Demenz bei der Parkinson-Krankheit zusammenhängen. Im Rahmen der Sequenzierung mit Hilfe der Kettenabbruchmethode nach Sanger wurden insgesamt 8 Einzelnukleotid-Polymorphismen identifiziert, darunter 7 missense Mutationen und eine synonyme Variante. Apolipoprotein A1 und Very-Low-Density-Lipoprotein Receptor wiesen keine Mutation auf. Eine statistische Signifikanz konnte für keinen Einzelnukleotid-Polymorphismus gezeigt werden. Dementsprechend konnte kein eindeutiger Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein einer Mutation und der Ausbildung einer Parkinson-Demenz in der vorliegenden Stichprobe abgeleitet werden. In der Tendenz waren jedoch 2 Mutationen hervorzuheben: rs7982 (Apolipoprotein J Exon 5) mit einer Odds ratio von 1.575 (95% Konfidenzintervall=0.680~3.646, p=0.288) sowie rs2066714/ rs4149313 (Adenosine Triphosphate-binding Cassette Transporter A1 Exon 18) mit einer Odds Ratio von 1.4 (95% Konfidenzintervall=0.551~3.554, p=0.478). Apolipoprotein J und Adenosine Triphosphate-binding Cassette Transporter A1 stellen somit als mögliche Risikogene der Parkinson-Demenz das Ziel weiterer Analysen dar. Als Limitation der Arbeit war die geringe Fallzahl bei initial zu hoch geschätzter Effektgröße zu betrachten, sodass die fokussierte Untersuchung in Bezug auf oben genannte Mutationen an weiteren Patienten der LANDSCAPE Studie sinnvoll und in Zukunft geplant ist

Punktmutationsanalysen bei GLI3-assoziierten Krankheitsbildern: Greig Cephalopolysyndaktylie-Syndrom, Pallister-Hall-Syndrom und isolierte Polydaktylien

Für die Ausbildung der Extremitäten ist eine Vielzahl von Genen verantwortlich. Eine Schlüsselrolle in der Entstehung der anterior-posterioren Polarität der Extremitäten spielt die Sonic Hedgehog-Patched-GLI Signalkaskade (SHH-PTCH-GLI Signalkaskade). Kommt es durch Mutationen zur Fehlregulation eines der beteiligten Faktoren im SHH-Pathway, so resultieren in der Regel, aber nicht ausschließlich, Dysmorphogenesen der Gliedmaßen. Zu diesen zählen auch die in dieser Arbeit untersuchten GLI3- assoziierten Morphopathien. Verschiedene Punktmutationen konnten im humanen GLI3-Gen (7p13), das für einen Transkriptionsfaktor mit Zinkfingermotiven kodiert, detektiert werden. Bisher wurden vier autosomal-dominant vererbte Fehlbildungssyndrome GLI3-Mutationen zugeordnet: 1. Greig Cephalopolysyndaktylie-Syndrom (GCPS) 2. Pallister-Hall-Syndrom (PHS) 3. Postaxiale Polydaktylie Typ A (PAP-A) 4. Präaxiale Polydaktylie Typ IV (PPD-IV) Im Rahmen dieser Arbeit konnten die Fallzahlen der GLI3-assoziierten Morphopathien erhöht werden. Als molekulargenetische Methode kamen für die Untersuchung der Patienten-DNA die nicht-radioaktive Einzelstrang-Konformationsananlyse (SSCA) sowie die Sequenzierung zur Anwendung. Insgesamt konnten 12 Mutationen bei Patienten mit klinisch diagnostiziertem GCPS, 2 Mutationen bei Patienten mit klinisch gesichertem PHS, sowie 2 weitere Mutationen bei Patienten mit PPD-IV im GLI3-Gen identifiziert werden. Dabei betreffen 9 Mutationen den N-Terminus oder die zentralen Zinkfingermotive der DNA-bindenden Domäne des GLI3-Transkriptionsfaktors. Weitere 7 Mutationen betreffen den C-terminalen Bereich. Die Erhöhung der Fallzahlen bestätigt und ergänzt das bekannte Spektrum der GLI3-Mutationen. Mindestens 8 der 16 detektierten Mutationen führen, durch den Einbau eines vorzeitigen Stoppcodons, zu einem verkürzten Protein und somit vermutlich zum Verlust einiger oder aller Funktionen des GLI3-Transkriptionsfaktors. Der Mechanismus der Haploinsuffizienz scheint in diesen Fällen den Phänotyp zu bedingen. Dagegen kann für die 4 identifizierten Missense-Mutationen sowie für die 3 Spleißstellenmutationen keine eindeutige Aussage über die Auswirkung auf Protein-ebene und somit über den molekularen Mechanismus, der den Phänotyp bedingt, getroffen werden. Entgegen der bisher angenommen 100%igen Penetranz von GLI3-Mutationen konnte eine Mutationsübertragung über eine phänotypisch gesunde Probandin im Fall der Missense-Mutation R625W nachgewiesen werden. Vor dem Hintergrund einer nicht vollständigen Penetranz sollten in Zukunft auch seltene Sequenzvarianten auf Proteinebene hinsichtlich veränderter GLI3 Funktionen und möglicher Interaktion mit anderen Faktoren untersucht werden. Die Entstehung der unterschiedlichen Phänotypen durch Mutationen im GLI3-Gen bleibt weiterhin unklar, denn die erhobenen Daten von nunmehr annähernd 50 Mutationen lassen keine eindeutige Genotyp-Phänotyp Korrelation an Hand von Lage und Art der Mutationen zu. Zur Klärung könnten weiterführende Experimente auf funktioneller Ebene (mRNA Transkript- und Proteinebene) beitragen. Drei Punktmutationen konnten mehrfach bei unverwandten Familien identifiziert werden, jedoch ist die Häufigkeit wiederholt auftretender Mutationen zu gering, um von sogenannten Mutations-Hotspots ausgehen zu können. Daher muss auch in Zukunft die molekulare Aufklärung von Defekten das gesamte GLI3-Gen erfassen

Regulationsmechanismen des Interferon regulatorischen Faktors IRF-4 in der chronisch myeloischen Leukämie

Zahlreiche Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Gruppe der Interferon-regulatorischen Faktoren (IRF), darunter insbesondere ICSBP und IRF-4, in der Pathogenese der CML eine wichtige Rolle spielt. In peripherem Blut von Patienten mit CML in der chronischen Phase ist die IRF-4-Expression im Vergleich zu Normalblut signifikant herunterreguliert. Eine Therapie mit Interferon-α vermag das IRF-4-Level der Patienten wieder anzuheben und zwischen gutem Ansprechen und hohem IRF-4-Level besteht eine positive Korrelation. Diese Daten könnten auf eine mögliche antileukämische Wirkungsweise von IRF-4 bei Erkrankungen des myeloiden Systems hinweisen. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der deregulierten IRF-4-Expression in Leukämiezellen untersucht. Die IRF-4-Promotor-Region von hämatopoetischen Zellinien, CML-Patienten und normalen Spendern als Kontrolle wurde dabei auf genetische und epigenetische Veränderungen untersucht. Um genetische Aberrationen auszuschließen, wurde der IRF-4-Promotor sequenziert. Dabei wurden keine genetischen Läsionen gefunden, die für die inhibierte IRF-4-Transkription verantwortlich sein könnten. Die detektierten Variationen an Position -1081 (T→C-Substitution), an Position -1068 (A→C-Substitution) und Position -116 (T→C-Substitution) finden sich sowohl in IRF-4-positiven als auch in IRF-4-negativen Zelllinien; die letztgenannte Substitution taucht zudem auch bei CML-Patienten in chronischer Phase und in Normalblut von Kontrollpersonen auf. Diese Basenpaarvariationen sind folglich sehr wahrscheinlich nicht die Ursache für die Expressionsunterschiede und stellen eher Polymorphismen dar. Keine der beschriebenen Sequenzänderungen betrifft eine bekannte Transkriptionsfaktorbindungsstelle. Die bei CML-Patienten in vivo nachgewiesene Induzierbarkeit der IRF-4-Expression macht reversible Inhibitionsmechanismen ohnehin wahrscheinlicher. Deshalb wurde der IRF-4-Promotor auf aberrante Methylierung untersucht, welche bereits bei einem anderen IRF, IRF-7, nachgewiesen wurde. Um die Relevanz dieses epigenetischen Mechanismus für die IRF-4-Regulation zu untersuchen, wurden verschiedene Zellinien mit demethylierenden Substanzen behandelt. Die Inkubation mit 5-Aza-2-deoxycytidin zeigte eine konzentrations- und zeitabhängige Aktivierung der IRF-4-Expression, die auf mRNA- und Proteinebene nachgewiesen werden konnte. Um den Methylierungsstatus des IRF-4-Promotors zu bestimmen, wurden ein Restriktions-PCR-Assay sowie die Sequenzierung des Promotors nach Bisulfit-Behandlung durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die IRF-4-negativen Zellinien ein höheres Methylierungslevel aufwiesen als die IRF-4-positiven Zellen und dass die IRF-4-Expression zudem mit dem Methylierungsstatus spezifischer CpGs im Promotor korreliert. Von besonderem Interesse ist dabei die Hypermethylierung einer NFκB-Bindungsstelle in IRF-4-negativen Zellinien. Die Bindung von c-Rel an NFκB-Elemente des Promotors spielt eine wichtige Rolle in der Induktion von IRF-4 und die Methylierung dieses Elements blockiert die Bindung des Transkriptionsfaktors. Ein im Anschluss an diese Arbeit durchgeführter Reporter-Gen-Assay konnte schließlich den inhibierenden Effekt von Methylierung auf den IRF-4-Promotor bestätigen. Die Bisulfit-Sequenzierung von DNA aus peripherem Blut von drei Normalpersonen und drei CML-Patienten in chronischer Phase zeigte keine aberrante Methylierung. Möglicherweise wurden hier jedoch die malignen Zellen im Gesamtblut nicht ausreichend erfasst; hier muss sich die Sequenzierung von sortierten Zellen anschließen. Eine mögliche und bei verschiedenen malignen Erkrankungen nachgewiesene Ursache für aberrante Methylierung ist die Überexpression von DNA-Methyltransferasen (DNMT). Die Expressionsanalyse der DNMTs (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B) und Methyl-CpG-Bindungsproteine (MBP) (MBD1, MBD2, MBD4, MeCP) zeigte jedoch keine konsistenten Unterschiede zwischen IRF-4-positiven und –negativen Zellinien, so dass der Hypermethylierung wahrscheinlich andere Mechanismen zugrunde liegen. Zusammenfassend lassen die erhobenen Daten die Schlussfolgerung zu, dass IRF-4-Promotor-Methylierung die IRF-4-Expression reguliert und das die aberrante Expression von IRF-4 in verschiedenen Leukämietypen eine Konsequenz einer IRF-4-Promotor-Hypermethylierung sein könnte. Inwieweit dieser Mechanismus in vivo wirksam ist, muss, beispielsweise durch Analyse von Subpopulationen aus Patientenproben, noch bestimmt werden

Mutationsanalysen bei hereditären Salzverlusttubulopathien

Der Begriff Bartter-Syndrom stellt den historisch bedingten Sammelbegriff für einige hereditäre Tubulopathien dar, denen eine chronische hypokaliämische metabolische Alkalose gemein ist. Heutzutage wird das Bartter-Syndrom in phänotypisch unterschiedliche Varianten aufgeteilt: 1. Die antenatale hyperkalziurische Form oder das Hyperprostaglandin-E-Syndrom (HPS), 2. das klassische Bartter-Syndrom (cBS), 3. die hypokalziurisch-hypomagnesiämische Variante oder Gitelman-Syndrom (GS) und 4. die antenatale hyperkalziurische Form (HPS) mit Taubheit (BSND-Bartter-syndrome with sensorineuronal deafness). Bezüglich des Erbgangs geht man aufgrund der familiären Häufung, der ausgeglichenen Geschlechterverteilung und des vermehrten Auftretens bei blutsverwandten (konsanguinen) Familien von einer autosomal-rezessiven Vererbung aus. Im Vordergrund der Arbeit stand die Mutationssuche und deren Analyse bei insgesamt 71 Patienten, von denen 34 das phänotypische Bild eines HPS und 22 das des cBS zeigten. 15 Patienten konnten klinisch keiner der beiden Gruppen eindeutig zugeordnet werden und wurden somit auf Mutationen in beiden unten angeführten Kanälen untersucht. Im ersten Teil wurde das Gen KCNJ1, welches für ROMK, einen apikal gelegenen Kaliumkanal im dicken Teil der Henleschen Schleife, kodiert, untersucht. Patienten mit Mutationen in diesem Kanal zeigen klinisch das Bild des HPS. Insgesamt konnten 19 relevante Mutationen beschrieben werden, wobei sich sowohl homozygote (5) als auch heterozygote (14) Mutationen fanden. Dabei handelte es sich um Punktmutationen (14), Deletionen (4) und eine Insertion. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das ClC-Kb-Gen, welches für den basolateralen Chloridkanal ClC-Kb im dicken aufsteigenden Teil der Henleschen Schleife kodiert, untersucht. Patienten mit einem solchen Kanaldefekt lassen sich phänotypisch dem cBS zuordnen. Es fanden sich 9 relevante Mutationen. Auch hier fanden sich sowohl heterozygote (8) als auch homozygote (1) Mutationen, von denen fünf Punktmutationen und drei Deletionen waren. Eine Mutationen erscheint als eine Kombination aus einer Insertion, einer Deletion und einer Punktmutation. Das Hauptziel beider Mutationsanalysen war es, die Bedeutung von ROMK und ClC-Kb in Bezug auf die Pathogenese des HPS bzw. cBS zu unterstreichen. Die große Anzahl der beschriebenen relevanten Mutationen ist ein Beleg für die herausragende Rolle beider Kanäle hinsichtlich dieser Bedeutung. Ferner sollten mögliche Korrelationen der Art der Mutation mit dem Schweregrad der klinischen Ausprägung einer der beiden Phänotypen aufgezeigt werden. Dies war zum einem aufgrund der vorliegenden klinischen Daten zum anderen aufgrund der unmittelbar nach der Geburt begonnenen Behandlung der pränatal diagnostizierten Patienten in den meisten Fällen nicht in anderen nur bedingt möglich. Es bleibt festzustellen, dass nur bei einem Teil der Patienten des untersuchten Kollektivs Mutationen beschrieben werden konnten. Dies rechtfertigt die Annahme, dass neben den bislang beschriebenen Kandidatengenen für die verschiedenen Entitäten des Bartter-Syndroms noch mindestens ein weiteres Gen existiert

Hauptgeneffekt auf die Entstehung exzremer Adipositas bei Kindern und Jugendlichen durch funktionell relevante Mutationen des Melanocortin 4 Rezeptor-Gens

Adipositas stellt in unserer Gesellschaft zunehmend nicht nur ein Problem für die Gesundheit und Lebensqualität des Betroffenen, sondern auch eine sozioökonomische Belastung für die Gemeinschaft dar. Zahlreiche Studien in den letzten Jahren unterstreichen dabei neben Umwelteinflüssen die Wichtigkeit genetischer Faktoren bei der Entstehung der Adipositas. Bei Familienstudien, Mausmodellen und epidemiologischen Untersuchungen erwies sich der Melanocortin 4 Rezeptor als ein wichtiges Kandidatengen, und in Folgestudien wurden zahlreiche adipöse Träger von Mutationen und Polymorphismen in diesem Gen beschrieben. In dieser Arbeit wurde die Rolle der MC4R Mutationen bei der Entstehung der Adipositas und deren Vererbungsmechanismen präzisiert. Dazu wurden 520 extrem adipöse Kinder und Jugendliche sowie deren Eltern mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion, der Einzelstrang- Koformationsanalyse und der Sequenzierung systematisch auf Veränderungen in der gesamten kodierenden Nukleotidsequenz des MC4R durchgeführt. Es wurden insgesamt 14 elterliche Mutationsträger und 11 Indexpatienten mit Mutation detektiert, wobei drei Indexprobanden und zwei Elternteile zwei Mutationen gleichzeitig aufwiesen. Unter den Mutationen fanden sich acht bis zu dem Entstehungszeitpunkt der Arbeit noch nicht beschriebene Mutationen (GA Del Codon 250, T Del Codon 320, Ser-94-Arg, Val-95-Ile, Ile-121-Thr, Ser-127-Leu, Ala-244-Glu und Ile-317-Thr). Die Transmission mutierter elterlicher Allele auf die Nachkommen konnte somit bestimmt und mit Hilfe des Transmissions Disequilibrium Tests bewertet werden. Dabei ergab sich, dass die 14 elterlichen Träger einer funktionell relevanten Mutation in 85,7 % das entsprechende Allel auf die Nachkommen transmittierten. Es zeigte sich auch, dass die elterlichen Mutationsträger einen höheren BMI als die übrigen untersuchten Eltern aufwiesen. Weiterhin war auffällig, dass von den detektierten 35 elterlichen Trägern des Val-103-Ile Polymorphismus das entsprechende Allel nur in acht Fällen auf den Indexprobanden transmittiert wurde. Dies deutet auf einen protektiven Effekt dieses Polymorphismus auf die Entstehung von Adipositas hin. Insgesamt sprechen die signifikant höhere Frequenz von funktionell relevanten Mutationen bei Adipösen im Vergleich zu nicht adipösen Kontrollen und die signifikanten TDT Ergebnisse für einen Hauptgeneffekt der MC4R Mutationen auf die Entstehung der Adipositas

Ermittlung der m-RNA-Expressionsmuster der c-jun, c-fos und c-myc Proto-Onkogene nach ex vivo Ballondilatation von Schweinekarotiden mittels semiquantitativer RT-PCR.

Ziel der Arbeit war die Ermittlung der mRNA Muster dreier Proto-Onkogene nach Ballondilatation in einem serumfreien Modell mit Hilfe einer zu etablierenden semiquantitativen RT PCR ohne die Verwendung radioaktiver oder fluoreszierender Substanzen. Zunächst konnten dafür die noch nicht bekannte c-jun und c-myc Gene des Schweins in kurzen Sequenzabschnitten erfolgreich ansequenziert werden. Um für die Sequenzierung geeignete homogene Fragmente zu erhalten, wurde mit Primern, die durch Vergleiche bekannter c-myc bzw. c-jun Sequenzen anderer Spezies konstruiert wurden, eine spezifische PCR durchgeführt. Anschließend konnten die Fragmente aus den Agarosegelen in sehr guter Qualität eluiert werden, wobei diese Methode bisher nicht genutzt wurde und hier zunächst optimiert werden mußte. Als problematisch erwiesen sich in den Vorversuchen die anfangs verwendeten Schlachthofgefäße. Mechanische Belastungen der Gefäße während der Entnahme aus den Schweinen im Schlachthof waren nicht zu verhindern. Um eine Verzerrung der Ergebnisse zu vermeiden, wurden für die semiquantitativen PCRs sowie für den Nachweis der Primerspezifität ausschließlich Karotiden verwendet, die unter OP Bedingungen durch Tierärzte des MPI Bad Nauheim entnommen wurden. Diese Gefäße wurden nach einer standardisierten Methode präpariert, dilatiert sowie teilweise mit Kollagenase A behandelt und anschließend inkubiert. Die RNA-Isolierung erfolgte auf chemischen Weg mittels Phenollösungen. Auch dieses Protokoll mußte hier erst optimiert werden. Zudem konnte ein effizientes Verfahren der Homogenisierung, alternativ zur Zerkleinerung, mit Hilfe von Ultraturax oder Ultraschall etabliert werden. Für die nachfolgenden PCRs konnten spezifische Primer entsprechend den beiden sequenzierten Abschnitten sowie für c fos, dessen Sequenz der Gendatenbank entnommen wurde, konstruiert werden. Nachdem der Nachweis der Primerspezifität gelang, konnten mit semiquantitativen PCRs, die in Vorversuchen optimiert wurden, Rückschlüsse auf die mRNA Spiegel in den Ausgangsproben gezogen werden. Die im Verlauf dieser Arbeit entwickelte Methode zur semiquantitativen Analyse von Genexpressionen mittels RT PCR ist gut geeignet, um unterschiedliche mRNA Spiegel nachzuweisen. Voraussetzungen sind, daß man Vergleiche zum Zeitpunkt des exponentiellen Reaktionsverlaufs der PCR trifft und daß gleiche Mengen an cDNA in die Reaktion einsetzt werden. Als Ergebnis der semiquantitativen PCRs fand sich eine verminderte Genablesung des c jun Gens bei den vom Endothel befreiten Gefäßen bei einer Dilatation und Inkubation in serumfreien Medien sowie eine Erhöhung der c fos Expression bei Gefäßen ohne Kollagenasebehandlung, die jedoch aufgrund der geringen Fallzahl nicht statistisch signifikant war. Die bislang unter in vivo-Bedingungen – d.h. unter dem Einfluß von Faktoren des Serums und aus Thrombozyten - beschriebene Steigerung der c-jun- und c-myc-Genexpression endothelhaltiger Gefäße konnte nicht nachgewiesen werden. Weiterhin zeigte sich eine deutliche Hochregulation des  Aktin Gens in beiden Versuchsreihen, eine Hochregulation des sm MLCK Gens sowie eine verminderte Expression des GAPDH Gens bei den endothellosen Gefäßen. Diese nachgewiesenen Veränderungen der mRNA-Spiegel der Proto-Onkogene jun, myc und fos nach Ballondilatation wurden erstmalig in einem thrombozyten- und serumfreien Tiermodell beobachtet. Bisher in der aktuellen Literatur beschriebene Modelle sind immer in serum- oder thrombozytenhaltigem Milieu durchgeführt worden. Damit ist das Ergebnis im Einklang mit den diesbezüglichen aktuellen Veröffentlichungen in der Literatur. Zusätzlich konnte mit histologischen Präparaten von den Gefäßen in HE- und EvG/Elastica-Färbungen belegt werden, daß sowohl dilatierte als auch Kontrollgefäße nicht bei der Präparation zerstört wurden und die Gefäßwand nach Dilatation intakt war. Beweise für eine Denudation zeigten sich nicht

Molecular-genetic analysis on the GWAS-based candidate obesity gene TUFM (Tu translation elongation factor mitochondrial gene) in extremely obese children and adolescents

Genetischen Faktoren wird eine große Rolle in der Entstehung von Übergewicht und Adipositas zugeschrieben. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein Kandidatengen für Adipositas auf das Vorliegen von Mutationen zu überprüfen, die eine Assoziation mit erhöhtem Körpergewicht zulassen. Die Auswahl des Kandidatengens erfolgte aufgrund einer genomweiten Assoziationsstudie (GWAS), deren Ergebnisse als Grundlage für die Auswahl des Kandidatengens dienten. Als Kandidat wurde das Tu translation elongation factor mitochondrial gene (TUFM) ausgewählt, da es bei einer genomweiten Assoziationsstudie als mögliches, assoziiertes Gen in der chromosomalen Region 16p11.2 in Frage kam. Wir führten ein Mutationsscreening mit anschließender Genotypisierung an einer Gruppe von insgesamt 95 extrem adipösen Kindern und Jugendlichen durch, die für einen bestimmten Genotyp angereichert war, und verglichen die Ergebnisse mit einer Normalpopulation. Bei diesem Screening des Gens TUFM hinsichtlich einer Relevanz für die Ausprägung von Adipositas im Kindes- und Jugendalter wurden im Rahmen dieser Arbeit die Exons 3,4,5,6,7,8 und 9 betrachtet. Mehrere Exons wurden zum Screening in Fragmente zusammengelegt, so dass auch z.T. intronische Bereiche betrachtet wurden. Das Mutationsscreening fand mittels Einzelstrangkonformationsanalyse (SSCP) und denaturierender Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (dHPLC) statt, die sich anschließende Genotypisierung erfolgte mittels allelspezifischer PCR (ARMS-PCR) und Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP). Innerhalb der betrachteten Fragmente fanden sich drei bereits beschriebene single-nucleotid-polymorphismen (SNPs), die alle im intronischen Bereich liegen. Als Vergleichsgruppe diente eine erwachsene europäische Normalpopulation des „1000 genomes Projects“. Es zeigten sich im Vergleich beider Gruppen deutlich Unterschiede in der Mittleren Allelfrequenz (MAF). Ausreichende Schlüsse für die Relevanz an der Entstehung von Adipositas lassen sich jedoch nur eingeschränkt ziehen, da die untersuchte Gruppe für einen bestimmten Genotyp angereichert war.Genetic factors play a major role in the development of overweight and obesity. The aim of this study was to examine a candidate gene for obesity for mutations, which allow an association with increased body weight. The candidate gene was selected on the basis of a genome-wide association study (GWAS). The Tu translation elongation factor mitochondrial gene (TUFM) was chosen as candidate because it was associated with obesity in the chromosomal region 16p11.2. We performed mutation screening with subsequent genotyping on a group of a total of 95 extremely obese children and adolescents enriched for a particular genotype and compared the results with a normal population. In this study the exons 3,4,5,6,7,8 and 9 of TUFM were screened with regard to a relevance for the expression of obesity in childhood and adolescence. Several exons were put together in fragments for screening so that some Intronic areas were also screened. The mutation screening was performed by single-strand conformational analysis (SSCP) and denaturing high-pressure liquid chromatography (dHPLC), followed by genotyping using allele-specific PCR (ARMS-PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP). Within the fragments, three already described single-nucleotide polymorphisms (SNPs) were found, all in the intronic range. As comparative group served an adult European standard population of the "1000 genomes Project". Comparing both groups, differences in the mean allele frequency (MAF) were visible. However, sufficient conclusions regarding the relevance to the development of obesity can only be drawn to a limited extent, since the investigated group was enriched for a particular genotype