Verification Report on the extraction and analysis of GM pollen DNA in honey

Following the judgment of 06 September 2011 on GM honey by the European Court of Justice (legal case C-442-09), the European Union Reference Laboratory for Genetically Modified Food and Feed (EU-RL GMFF) established by Regulation (EC) No 1829/2003, performed an in-house study to test the extraction and PCR analysis of genomic DNA from genetically modified pollen in honey. The present report documents on an extraction method for isolation and analysis of pollen DNA present in honey, including the isolation and analysis of isolated genomic pollen DNA using real-time PCR on commercial honey samples and honey samples spiked with various levels of GM MON 810 pollen.JRC.I.3-Molecular Biology and Genomic

Improved Protein Characterizations using Ionic Liquids: PAGE and MALDI-MS

Protein separation by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and identification by matrix assisted laser desorption ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) are primary tools of protein analysis. In these techniques, surfactants are used in protein sample preparation in order to enhance the protein solubility. Conventional surfactants have shown limitations in protein analysis due to the structural complexity of proteomes, resulting in low resolution. The research goal of this dissertation is to address some of these limitations by applying novel cationic ionic liquid surfactants (ILS), N-alkyl-4-methyl pyridinium bromide (CnPBr where n=4, 8, 11). The ILS would be suitable candidates to be used in PAGE protein separations as a result of positive cooperative binding to proteins at low concentrations of ILS and protein denaturing ability at room temperature. These compounds were used as buffer additives in ILS-PAGE protein separation and matrix additives in MALDI-MS protein identification. Anionic ILS-PAGE was used to separate a mixture of acidic proteins by applying ILS in sample and running buffers. Protein separation was improved for transferrin and ovalbumin, which were resolved as multiple bands of isoforms. In cationic ILS-PAGE, ILS were applied in polyacrylamide gels in addition to sample and running buffers. Separation of both acidic and basic proteins as sharp bands with high resolution is a major advancement of this technique. Cationic ILS-PAGE was used to resolve ribonuclease b glycoforms as multiple protein bands. In contrast, the same protein was migrated as a single band in Sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE. Moreover, alpha antitrypsin glycoforms were resolved as multiple spots by two dimensional (2D) Isoelectric focusing (IEF)/ILS-PAGE. Furthermore, C4PBr and C8PBr ILS were applied as matrix additives with MALDI matrix, α-cyanohydroxycinnamic acid (CHCA), to perform protein sample analysis as well as rat brain tissue profiling. ILS showed high protein signal intensity at low concentrations (0.02% (w/v)) in protein samples compared to SDS, cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB), and no surfactants present (blank). A large number of new protein peaks were acquired from tissue sample as compared to the absence of ILS in the matrix. These results show the applicability of ILS in improved protein identification by MALDI imaging mass spectrometry

Investigation of upstream and downstream events in CERK1-mediated signaling in plant immunity

As one part of a two-tiered pathogen-detection system in plants, PTI is not only sufficient to ward off most microbes, but also contributes to basal immunity during infection. Although PGN and the LYM1-LYM3-CERK1 receptor complex have been identified as one PAMP-PRR pair in Arabidopsis, upstream and downstream events of PGN perception remain elusive. Specifically, it is unclear whether and, if so, how PGN supermolecules are processed prior to perception by the LYM1-LYM3-CERK1 receptor complex. Moreover, the mechanisms linking PGN perception with diverse downstream immune responses are little understood. In this study, a lysozyme-like hydrolase (lysozyme 1, LYS1) was identified as an enhancer in PGN-induced immunity. Upon bacterial infection or exposure to bacterial patterns, Arabidopsis produces LYS1 to release soluble PGN fragments from insoluble bacterial cell walls. LYS1-released soluble PGNs trigger typical immunity-associated responses, such as medium alkalinization and up-regulation of resistance-related genes. Importantly, these immune responses are dependent on the PGN receptor complex. LYS1 mutants exhibit super-susceptibility to bacterial infection similar to that oberved in PGN receptor mutants. We propose that plants employ hydrolytic activities for the decomposition of complex bacterial structures and that the subsequent generation of soluble patterns might aid PRR-mediated immune activation in cell layers adjacent to infection sites. In addition, we identified the calcium-dependent protein kinase CPK15 as an interactor of CERK1, which is not only involved in PGN perception but also in chitin recognition. CPK15 was shown to interact with CERK1 in the yeast-two-hybrid system and in plant tissue, and cpk15 mutants displayed reduced ROS accumulation upon chitin treatment. These findings indicate that CPK15 is involved in CERK1-mediated PTI signaling. Summing up, this study aimed at improving our understanding of PGN- and chitin-triggered immunity by identifying and characterizing critical components of the plant immune system, such as LYS1, involved in upstream events of PGN perception, and CPK15, involved in dowstream events of CERK1-mediated glucan perception

Degradation of 3-phenylpropionic acid by Haloferax sp. D1227

Thesis (Ph. D.)--Michigan State University. Department of Microbiology, 1997Includes bibliographical references (pages 117-119

Galactose and Glucose Metabolism in Haloferax volcaniipathways, enzymes and transcriptional regulation

Genomanalysen deuten darauf hin, dass in dem Haloarchaeon Haloferax volcanii Galactose über einen DeLey-Doudoroff- (DD) Weg abgebaut wird. Der Transport von Galactose und die beteiligten Enzyme des Galactose-Abbaus wurden bisher nicht untersucht. Genomanalysen des Haloarchaeons Halorhabdus utahensis deuten darauf hin, dass Galactose, anders als für H. volcanii postuliert, über einen Leloir-Weg abgebaut wird. Untersuchungen zum Galactose-Abbau in H. utahensis wurden bisher nicht durchgeführt. Weiterhin deuten Untersuchungen darauf hin, dass Glucose in H. volcanii über einen semiphosphorylierten Entner-Doudoroff- (spED) Weg abgebaut wird. Das Schlüsselenzym dieses Wegs, die KDPG-Aldolase, wurde bisher nicht detailliert charakterisiert. Die Enzyme der Oxidation von Glycerinaldehyd-3-Phosphat (GAP), einem Intermediat des Galactose- und Glucose-Abbaus in H. volcanii wurden nicht untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurden der Transport und der Abbau von Galactose, sowie die transkriptionelle Regulation der Gene des Galactose-Abbaus in H. volcanii untersucht. In H. utahensis wurde das Schlüsselenzym des Leloir-Wegs charakterisiert. Außerdem wurde die KDPG-Aldolase, sowie die Enzyme der GAP-Oxidation zu 3-Phosphoglycerat in H. volcanii detailliert untersucht. Im Folgenden werden die in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse zusammengefasst...Genome analyses suggest that in the halophilic archaeon Haloferax volcanii galactose is degraded via a DeLey-Doudoroff pathway (DD). The transport of galactose and the enzymes involved in galactose degradation in H. volcanii have not been characterized so far. Genome analyses of the halophilic archaeon Halorhabdus utahensis suggest, that galactose, in contrast to H. volcanii, is degraded via the classical Leloir-pathway. Enzymes involved in galactose degradation in H. utahensis have not been analyzed so far. Furthermore, recent studies indicate that glucose is degraded via a semiphosphorylative Entner-Doudoroff pathway (spED). The key enzyme of this pathway, KDPG aldolase, has not been characterized in detail. Also, the enzymes involved in oxidation of glyceraldehyde-3-phosphate (GAP), an intermediate of galactose and glucose catabolism in H. volcanii, have not been analyzed so far. In this thesis the transport and degradation of galactose as well as transcriptional regulation of the genes involved in galactose degradation in H. volcanii were investigated. In H. utahensis the key enzyme of Leloir pathway was characterized. Moreover, KDPG aldolase, the key enzyme of glucose degradation as well as enzymes catalyzing GAP oxidation to 3-phosphoglycerate were investigated in detail in H. volcanii. The following results were obtained in this thesis..

Sugar metabolism in the halophilic archaeon Haloferax volcanii.Identification and characterization of enzymes of the fructoseand glucose metabolism and of the pentose phosphate pathway

Bisherige Untersuchungen zum Zuckerstoffwechsel in Archaea deuten darauf hin, dass in halophilen Archaea Fructose über einen modifizierten Embden-Meyerhof- (EM) Weg und Glucose über einen semiphosphorylierten Entner-Doudoroff- (ED) Weg abgebaut wird. Die Enzyme und die codierenden Gene für den Transport und den Abbau von Fructose wurden jedoch bisher nicht identifiziert und charakterisiert. Auch das Schlüsselenzym des ED-Wegs, die 2 Keto-3-desoxygluconat (KDG) Kinase, wurde bisher nicht identifiziert. Weiterhin lagen keine Daten zu den Enzymen vor, die in halophilen Archaea an der Bildung von Pentosephosphaten aus Hexosen beteiligt sind. In der vorliegenden Arbeit wurden Enzyme des Fructoseabbaus aus dem halophilen Modellorganismus Haloferax volcanii sowie der funktionell an der Fructoseaufnahme beteiligte Transporter identifiziert. Weiterhin wurde die funktionell am Glucoseabbau beteiligte KDG Kinase (KDGK) aus H. volcanii identifiziert und Enzyme des oxidativen Teils des Pentosephosphatwegs charakterisiert. Transport und Abbau von Fructose in H. volcanii Im Genom von H. volcanii wurde ein Cluster identifiziert, der für alle fünf Komponenten eines fructosespezifischen Phosphotransferase Systems (PTS) codiert. In Nachbarschaft dieses Bereichs wurden zwei Gene annotiert, die für die putativen Enzyme 1 Phosphofructokinase (1 PFK) und Fructose-1,6-bisphosphat (FBP) Aldolase (FBA) codieren (pfkB bzw. fba). Die Beteiligung der PTS Komponenten und der beiden Enzyme am Fructosestoffwechsel wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht. Northern-Blot Experimente ergaben, dass alle PTS Komponenten als Cotranskript bei Wachstum auf Fructose transkribiert wurden. Eine Deletionsmutante, bei der die PTS Transmembrankomponente EIIC (codiert von ptfC, wobei ptf für Phosphotransferase System für Fructose steht) chromosomal deletiert war, wurde generiert. Diese wuchs nicht mehr auf Fructose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle, aber unverändert auf Glucose, was für die funktionelle Beteiligung des PTS im Fructosestoffwechsel von H. volcanii spricht. Das PTS in H. volcanii ist der erste Nachweis eines funktionellen PTS in der Domäne der Archaea. Auf Grund von Sequenzhomologien und dem Vergleich der Genomorganisation zeigten die halophilen PTS Komponenten die größte Ähnlichkeit zu bakteriellen Homologen aus grampositiven Bakterien. Dies spricht für eine Aufnahme des PTS über einen lateralen Gentransfer von grampositiven Bakterien. Neben den PTS Komponenten war auch die Transkription von pfkB und fba bei Wachstum auf Fructose stark induziert. Mutanten, bei denen pfkB bzw. fba deletiert waren, konnten nicht mehr auf Fructose, jedoch auf Glucose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen, was für eine funktionelle Beteiligung der Enzyme am Abbau von Fructose spricht. 1-PFK und FBA wurden homolog in H. volcanii exprimiert und die gereinigten, rekombinanten Enzyme wurden charakterisiert. 1-PFK katalysierte die ATP abhängige Phosphorylierung von Fructose-1-phosphat (F1P) und Fructose-6-phosphat (F6P) zu Fructose-1,6-bisphosphat (FBP). Die katalytische Effizienz für die Umsetzung von F1P war etwa 36 fach höher als für F6P, was zeigt, dass F1P das physiologische Substrat der 1 PFK darstellt. Die rekombinante FBA wurde als eine metallabhängige Class II Aldolase beschrieben, die sowohl die Spaltung von FBP zu Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP), als auch die umgekehrte Reaktion, das heißt die Aldolkondensation, katalysierte. Weiterführende Experimente mit der fba Deletionsmutante zeigten, dass fba in H. volcanii auch essentiell an der Gluconeogenese beteiligt ist. Phylogenetische Analysen ergaben, dass die FBA mit anderen putativen halophilen FBAs einen Cluster bildet, der separat von den bisher charakterisierten Class II Aldolasen liegt. KDG Kinasen aus H. volcanii Das Schlüsselenzym des semiphosphorylierten ED-Wegs des Glucoseabbaus, die KDG Kinase, wurde identifiziert und charakterisiert. Das Genom von H. volcanii enthält mit kdgK1 und kdgK2 zwei homologe Gene, die für die putativen KDG Kinasen KDGK-1 und KDGK-2 codieren. kdgK2 liegt in genomischer Nähe zu putativen galactosespezifischen Genen, was auf eine mögliche Funktion von KDGK-2 als 2-Keto-3-desoxygalactonat (KDGal) Kinase hinweisen könnte. Um zu prüfen, welche der beiden möglichen KDG Kinasen funktionell am Glucoseabbau beteiligt ist, wurde die Transkription beider Enzyme untersucht, die rekombinanten Enzyme exprimiert, gereinigt und charakterisiert, sowie das Wachstum von kdgK Deletionsmutanten auf Glucose und Galactose analysiert. Die Expression von kdgK1 auf Glucose und Galactose war konstitutiv. KDGK-1 katalysierte die ATP-abhängige Phosphorylierung von KDG mit einer etwa dreifach höheren katalytischen Effizienz als die Umsetzung von KDGal. Die kdgK1 Deletionsmutante wuchs nicht mehr in Medium mit Glucose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle, wogegen das Wachstum auf Galactose unverändert war. Dies spricht dafür, dass kdgK1 für die funktionelle KDG Kinase beim Abbau von Glucose im semiphosphorylierten ED-Weg von H. volcanii codiert. Die Expression von kdgK2 auf Galactose war stark induziert und die rekombinante KDGK-2 katalysierte die Phosphorylierung von KDGal mit einer 50 fach höheren katalytischen Effizienz als die Umsetzung von KDG. Die hohe Expression von kdgK2 auf Galactose sowie die hohe Spezifität für KDGal deuten darauf hin, dass es sich bei der KDGK-2 in vivo um eine funktionelle KDGal Kinase handelt. Oxidativer Teil des Pentosephosphatwegs in H. volcanii Die Enzyme des oxidativen Teils des Pentosephosphatwegs, die in H. volcanii die Umwandlung von Glucose zu Ribulose-5-phosphat katalysieren, wurden analysiert. In H. volcanii wurden Gene für eine putative ROK Kinase (ROK steht für Repressoren, ORFs unbekannter Funktion und Kinasen) und eine putative 6-Phosphogluconat Dehydrogenase annotiert. Ein Gen für eine bekannte Glucose-6-phosphat (G6P) Dehydrogenase war nicht annotiert. In der vorliegenden Arbeit wurden die ROK Kinase und die 6-Phosphogluconat Dehydrogenase als rekombinante Proteine nach homologer Expression gereinigt und charakterisiert, sowie eine G6P Dehydrogenaseaktivität aus H. volcanii Zellextrakt gereinigt und identifiziert. Die ROK Kinase katalysierte die ATP-abhängige Phosphorylierung von Glucose zu G6P mit apparenten Km- und Vmax-Werten von 0,16 mM und 182 U/mg. Andere Zucker wurden nicht oder nur mit geringer katalytischer Effizienz umgesetzt. Zum Vergleich mit anderen archaeellen Enzymen wurde eine zweite ROK Kinase aus dem Crenarchaeon Desulfurococcus kamchatkensis charakterisiert. Im Gegensatz zur halophilen ROK Kinase aus H. volcanii katalysierte diese nicht nur die Phosphorylierung von Glucose, sondern auch die Umsetzung von Fructose und Mannose mit vergleichbaren katalytischen Effizienzen. In Übereinstimmung mit der unterschiedlichen Substratspezifität konnten die beiden charakterisierten Kinasen auch verschiedenen phylogenetischen Clustern zugeordnet werden. Aus Zellextrakten von H. volcanii wurde eine G6P Dehydrogenase bis zur apparenten Homogenität gereinigt und mittels MALDI-TOF Massenspektroskopie das codierende Gen identifiziert. Das Enzym katalysierte die NAD+ abhängige Oxidation von G6P mit einer Rate von 39 U/mg und apparenten Km-Werten von 5,4 mM und 0,18 mM für G6P und NAD+. NADP+ wurde nicht als Elektronenakzeptor verwendet. Phylogenetische Untersuchungen ergaben, dass die G6P Dehydrogenase aus Haloferax eine neuartige G6P Dehydrogenase ist, die der extended short-chain dehydrogenase/reductase (SDRe) Familie zugeordnet werden kann. Dies ist die erste Beschreibung einer Glucose-6-phosphat Dehydrogenase in der Domäne der Archaea. Die rekombinante 6-Phosphogluconat Dehydrogenase katalysierte die NAD+ abhängige Oxidation von 6-Phosphogluconat mit apparenten Km- und Vmax-Werten von 0,021 mM und 10,6 U/mg. NADP+ diente nicht als physiologischer Elektronenakzeptor. Die Ergebnisse zeigen, dass H. volcanii Enzyme enthält, die Glucose über G6P zu Ribulose-5-phosphat umsetzen.Comparative analyses on sugar catabolism revealed that degradation of fructose in halophilic archaea is carried out by a modified Embden-Meyerhof (EM) pathway whereas glucose is degraded via a semiphosphorylative Entner-Doudoroff (ED) pathway. However, enzymes and coding genes for the transport and degradation of fructose have not been identified and characterized yet. Furthermore, 2-keto-3-deoxygluconate (KDG) Kinase, the key enzyme of the semiphosphorylative ED pathway, has not been identified. Moreover, no enzymes for the generation of pentose phosphates from hexoses have been described in halophilic archaea. In this study, enzymes of the fructose catabolism from the halophilic model organism H. volcanii have been identified and characterized. Furthermore, the functionally involved fructose transport system was identified. Also the KDG Kinase (KDGK), which is functionally involved in glucose catabolism in H. volcanii, has been identified, and enzymes of the oxidative pentose phosphate pathway have been characterized. Transport and Degradation of Fructose in H. volcanii Analyses of the H. volcanii genome indicate the presence of a cluster, encoding homologs of all five bacterial phosphotransferase system (PTS) components. Directly upstream and downstream of this cluster, respectively, genes coding for putative fructose-1phosphate kinase (1-PFK) and fructose-1,6-bisphosphate aldolase (FBA) were annotated (pfkB respectively fba). In this study, the functional involvement of the PTS components and the two enzymes 1-PFK and FBA in fructose catabolism has been investigated. Northern blot analysis revealed that all PTS components were expressed as a cotranscript that was specifically upregulated by fructose. A mutant with chromosomally deleted PTS transmembrane component EIIC (encoded by ptfC, ptf stands for phosphotransferase system for fructose) was generated. The ptfC mutant did not grow on fructose as sole carbon and energy source, whereas growth on glucose was unaffected. These results indicate that ptfC and the entire PTS operon in H. volcanii is functionally involved in fructose uptake as a part of fructose catabolism. This is the first report of the functional involvement of a bacterial PTS in the domain of the archaea. Based on comparisons of sequences and genome organizations from the halophilic PTS to bacterial counterparts, a high degree of similarity to gram positive bacteria could be detected, indicating that the halophilic PTS might have been acquired via horizontal gene transfer from the domain of the bacteria. In analogy to the PTS components, fructose specific induction of pfkB and fba could be detected by Northern blot analyses. Mutants with chromosomally deleted pfkB or fba did not grow on fructose as sole carbon and energy source, but growth on glucose was not affected. These data indicate that pfkB and fba are essential for growth on fructose. 1-PFK and FBA were homologously expressed, purified and characterized. 1-PFK catalyzed the ATP dependent phosphorylation of fructose-1-phosphate (F1P) and fructose-6-phosphate (F6P) to fructose-1,6-bisphosphate (FBP). The catalytic efficiency (kcat/Km) of the enzyme for F1P was about 36 fold higher than for F6P, indicating that F1P is the physiological substrate defining the enzyme as F1P-specific kinase (1-PFK). FBA was described as metal dependent Class II aldolase, catalyzing the cleavage of FBP to glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) and dihydroxyacetone phosphate (DHAP). Moreover, it was shown that the enzyme catalyzed the reverse reaction. Further experiments with the fba deletion mutant showed that fba is essentially involved in gluconeogenesis of H. volcanii. Phylogenetic analyses revealed that halophilic FBAs formed a distinct cluster apart from other characterized aldolases, suggesting that haloarchaeal class II FBAs form a separate class II FBA subfamily. KDG Kinases of H. volcanii In this thesis, the key enzyme of the semiphosphorylative ED pathway, the KDG kinase, has been identified and characterized. H. volcanii codes for two putative KDG kinases with high sequence similarity (KDGK-1 and KDGK-2, encoded by kdgK1 and kdgK2). In close vicinity to kdgK2, putative galactose specific genes are annotated, indicating a possible role of KDGK-2 as 2-keto-3-deoxygalactonate (KDGal) Kinase. To check, which one of the kinases is functionally involved in glucose catabolism, transcription analyses were performed. Furthermore, the recombinant enzymes were expressed, purified and characterized and the growth of kdgK deletion mutants was analyzed. The expression of kdgK1 on glucose and galactose as sole carbon and energy source was constitutive. KDGK-1 catalyzed the ATP dependent phosphorylation of KDG and KDGal with an approximately threefold higher catalytic efficiency for KDG. The kdgK1 deletion mutant did not grow on glucose as sole carbon and energy source, whereas growth on galactose was not affected. These data indicate that kdgK1 is the functional KDG Kinase for the degradation of glucose via the semiphosphorylative ED pathway in H. volcanii. The expression of kdgK2 on galactose was highly induced and the recombinant KDGK-2 catalyzed the phosphorylation of KDGal with a 50 fold higher catalytic efficiency than the phosphorylation of KDG. The high expression of kdgK2 on galactose and the specificity of KDGK-2 for KDGal indicates that KDGK-2 is the functional KDGal Kinase in vivo. Oxidative Pentosephosphate Pathway in H. volcanii The enzymes of the oxidative pentosephosphate pathway that catalyze the transformation of glucose to ribulose-5-phosphate in H. volcanii have been analyzed. Genes encoding for the putative enzymes ROK kinase (ROK stands for repressors, open reading frames of unknown function and kinases) and 6-phosphogluconate dehydrogenase were found to be annotated in H. volcanii. However, the gene for a classical glucose-6-phosphate (G6P) dehydrogenase was not annotated. In this work, ROK kinase and 6-phosphogluconate dehydrogenase were homologously expressed, and the recombinant enzymes were purified and characterized. Furthermore, a novel G6P dehydrogenase from cell extract was purified and identified. The ROK kinase catalyzed the phosphorylation of glucose to G6P with apparent Km- and Vmax- values of 0.16 mM and 182 U/mg. Other sugars than glucose were not phosphorylated with high catalytic efficiency. For comparison to other archaeal enzymes, a second ROK kinase from the crenarchaeon Desulfurococcus kamchatkensis was characterized. Unlike the halophilic enzyme from H. volcanii, this kinase not only phosphorylated glucose but also other sugars like fructose or mannose with comparable catalytic efficiencies. In accordance to the difference in substrate specificity, the kinases formed distinct clusters in the phylogenetic tree. G6P dehydrogenase from H. volcanii cell extract was purified to homogeneity and the encoding gene was identified by MALDI-TOF mass spectrometry. The enzyme catalyzed the NAD+ dependent oxidation of G6P with a specific activity of 39 U/mg and apparent Km-values of 5.4 mM and 0.18 mM for G6P and NAD+, respectively. NADP+ was not used as electron acceptor. Phylogenetic analyses revealed that G6P dehydrogenase from Haloferax constitutes a novel G6P dehydrogenase that belongs to the extended short-chain dehydrogenase/reductase (SDRe) family. This is the first report of an archaeal G6P dehydrogenase. The recombinant 6-phosphogluconate Dehydrogenase catalyzed the NAD+ dependent oxidation of 6-phosphogluconate with apparent Km- and Vmax- values of 0.021 mM and 10.6 U/mg. The enzyme could not use NADP+ as physiological electron acceptor. The results show that H. volcanii codes for all genes that catalyze the conversion of glucose to ribulose-5-phosphate via glucose-6-phosphate

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Peer reviewedPostprin

Proteomanalyse zur Charakterisierung des ADAM17ex/ex hypomorphen Mausmodells

The ectodomain shedding of numerous transmembrane proteins by the A Disintegrin And Metalloprotease 17 (ADAM17) governs a variety of physiological and developmental processes. Focusing on murine embryonic fibroblasts (MEFs) of ADAM17wt/wt and ADAM17ex/ex (hypomorphic) mice, we investigated ADAM17-mediated changes in conditioned cell culture supernatants, in membrane preparations and in whole cell lysates using a 2D-DiGE proteomic approach. The detection of high amounts of cleaved TNFα in supernatants of TNFα-overexpressing wild-type but not ADAM17ex/ex MEF cells demonstrated the general suitability of the employed 2D-DiGE approach for the identification of shed protein fragments. Interestingly, the analyses of whole-cell lysates revealed that ADAM17 might also influence intracellular protein levels since a variety of proteins (e.g. annexins) showed altered abundances at reduced levels of ADAM17. From conditioned MEF supernatants, seventy differentially abundant secreted and cell-surface proteins were identified. These included collagens and other extracellular matrix components, several proteases and several protein fragments. Thus, wild-type and ADAM17ex/ex MEF cells clearly differ in their ability to secrete or shed proteins. However, only fourteen different protein fragments showed altered abundances in ADAM17ex/ex MEF cell supernatants, including only two known ADAM17 substrates (TNFα and NCAM-1). Notably, most full length proteins that were detected as fragments lack a transmembrane region and are thus no bona fide ADAM17 substrates. The high amounts of the perlecan LG3 peptide and of the type-I collagen C-terminal propeptide in supernatants of wild-type MEF cells point to a reduced collagen maturation and degradation in ADAM17ex/ex MEF cells. Since we also observed reduced levels of the C-procollagenase “bone morphogenic protein 1” and reduced matrix metalloproteinase activity in ADAM17ex/ex MEF cell culture supernatants, the observed processing of collagen and perlecan might reflect “proteolytic side effects” by other proteases in a complex “protease web”.Die Metalloprotease A Disintegrin And Metalloprotease 17 (ADAM17) vermittelt das Freisetzen der extrazellulären Domänen verschiedener Transmembranprotein (ectodomain shedding) und ist somit an verschiedensten physiologischen und entwicklungsbiologischen Prozessen beteiligt. Mit einem Fokus auf murine embryonale Fibroblasten (MEF) von ADAM17wt/wt und ADAM17ex/ex (hypomorphen) Mäusen haben wir ADAM17-abhängige Veränderungen in konditionierten Zellkulturüberständen, Membranfraktionen und Zelllysaten analysiert. Die Tauglichkeit der verwendeten 2D-DiGE Methode zur Identifizierung von Proteinfragmenten konnte dabei an Kulturüberständen von TNFα-überexprimierenden MEF-Zellen demonstriert werden. Im Gegensatz zu ADAM17ex/ex MEF-Zellen, konnten so in Kulturüberständen von wildtyp MEF-Zellen hohe Mengen an löslichem TNFα beobachtet werden. Darüber hinaus deutete die Analyse von Zelllysaten auch auf intrazelluläre Effekte von ADAM17 hin, da zahlreiche Protein (z.B. Annexine) veränderte Abundanzen unter reduzierter ADAM17 Aktivität zeigten. Aus konditionierten MEF-Kulturüberständen konnten siebzig differentiell abundante sekretierte und Zelloberflächenproteine identifiziert werden, darunter Kollagene und andere Komponenten der extrazellulären Matrix, verschiedene Proteasen und mehrere Proteinfragmente. Wildtyp und ADAM17ex/ex MEF-Zellen zeigen somit deutliche Unterschiede in Sekretion und Shedding von Proteinen. Insgesamt wurden jedoch lediglich vierzehn Proteinfragmente mit veränderter Abundanz in ADAM17ex/ex MEF-Zellen identifiziert, darunter zwei bekannte Substrate von ADAM17 (TNFα und NCAM-1). Interessanter Weise weisen die meisten Proteine, welche als Proteinfragmente identifiziert wurden keine Transmembrandomäne auf und sind somit kein bona fide ADAM17 Substrate. Der erhöhte Gehalt an dem Perlecan LG3-Peptid und dem C-terminalen Propeptid des Typ-I Kollagens in wildtyp MEF-Kulturüberständen deutet daneben auf eine Verminderte Reifung und Degradierung von Kollagenen in ADAM17ex/ex MEF-Zellen hin. Da wir außerdem eine reduzierte Abundanz der C-Procollagenase „bone morphogenic protein 1” und verminderte Matrixmetalloprotease-Aktivitäten in Kulturüberständen von ADAM17ex/ex MEF-Zellen beobachteten, könnten die beobachtete Veränderung der Kollagen- und Perlecanprozessierung ein “proteolytischer Nebeneffekt” durch andere Proteasen in einem komplexen „proteolytischen Netzwerk“ sein

Proteomische Analyse der Zellmembran humaner Erythrozyten als Wirtszellen des Malariaerregers Plasmodium falciparum (WELCH 1897)

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methodik zur Anreicherung und Isolierung der Wirtszellmembran von P. falciparum-infizierten Erythrozyten erarbeitet. Die Proteine dieser Membranfraktion wurden mittels optimierter 2D 16-BAC/SDS PAGE und 2D CTAB/SDS PAGE, sowie mittels 2D IEF/SDS PAGE aufgetrennt und anschließend durch MALDI TOF/TOF identifiziert. Dabei wurde gezeigt, dass die kationische 2D PAGE gegenüber der 2D IEF/SDS PAGE signifikante Vorteile bei der Auftrennung von Membranproteinen und Membran-assoziierten Proteinen dieser Fraktion besitzt. Außerdem wiesen die Gele der kationischen PAGE eine recht hohe Reproduzierbarkeit auf. Die anschließende massenspektrometrische Analyse ergab, dass beide PAGEs sich gegenseitig ergänzten und für einige der identifizierten Proteine eine Interaktion mit dem Zytoskelett oder der Membran der Wirtszelle postuliert werden kann. Darunter befanden sich auch Proteine der Rhoptrien und den Maurer´s clefts, sowie Proteine deren Funktion sowie Lokalisation bisher unbekannt sind. Aus diesen Daten wurde ein hypothetisches Modell der identifizierten Proteine von spät-infizierten Erythrozyten aufgestellt. Zum Vergleich wurden die Proteine der Membranfraktion in einer 1D SDS PAGE aufgetrennt, mittels LC-MALDI TOF/TOF analysiert und eine umfangreiche Liste mit proteomischen Daten erstellt. Dabei wurden 733 plasmodiale Proteine identifiziert, von denen 45 % als exportierte Proteine, Membranproteine oder Proteinen unbekannter Funktion bzw. Lokalisation zugeordnet wurden, was für eine adäquate Anreicherung exportierter und mutmaßlich exportierter Proteine durch die angewandte Methodik spricht. Das Verfahren der gelbasierten, kationischen PAGE wurde neben den Wirtszellproteinen später Stadien auch für diejenigen Proteine verwandt, die aus der Wirtszelle früh-infizierter Erythrozyten stammen. Für die Anreicherung von Erythrozyten, die mit viablen frühen Stadien von P. falciparum infiziert sind, wurde eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode entwickelt. Hierdurch wurde eine Anreicherung von mehr als 98 % erreicht. Bisher war es nicht möglich, eine solche Reinheit früher, lebensfähiger Parasitenstadien zu erreichen. Damit legt die hier erarbeitete Methode den Grundstein, um nun auch auf molekularer und proteomischer Ebene die verschiedenen Parasitenstadien miteinander quantitativ zu vergleichen. Danach wurde, analog zu den spät-infizierten Erythrozyten, die Wirtszellmembran angereichert und die Proteine extrahiert. Bei der 2D CTAB/SDS PAGE wurden drei plasmodiale Proteine gefunden, welche möglicherweise direkt nach der Invasion in die Wirtszelle vom Parasiten exportiert bzw. sezerniert wurden, um dort das Überleben des Parasiten sowie dessen Entwicklung innerhalb des Erythrozyten zu gewährleisten. Der Vergleich der 2D Gele von spät-infizierten Erythrozyten mit dem 2D Gel der früh-infizierten Erythrozyten ergab deutliche Unterschiede im Proteinbesatz der Membranfraktionen der unterschiedlichen Stadien. Dies zeigt die Notwendigkeit der stadienspezifischen Analyse des Parasiten und seiner Wirtszelle, um ein besseres Verständnis auf molekularer Ebene der von Seiten des Parasiten eingeleiteten Wirtszell-Modifikationen innerhalb des intraerythrozytären Entwicklungszyklus zu erlangen. Die Daten der vorliegenden Arbeit liefern erste Hinweise auf die Lokalisation verschiedener Proteine des Parasiten innerhalb der Wirtszelle, deren Funktion und Lokalisation bisher unzureichend aufgeklärt sind. Die Untersuchung dieser Proteine könnte wichtige Vorgänge bei der Modifikation der Wirtszelle im intraerythrozytären Entwicklungszyklus aufklären und so zu einem besseren Verständnis über die molekularen Interaktionen des Parasiten mit seiner Wirtszelle führen.In the present work, a method for the isolation and purification of the host cell membrane of P. falciparum-infected erythrocytes was established. From the membrane fraction, proteins were extracted and separated by optimized 2D 16-BAC/SDS PAGE or 2D CTAB/SDS PAGE. Subsequently, the proteins were analyzed by MALDI TOF/TOF and the data were compared to gels from classical 2D IEF/SDS PAGE. It is shown that the gels from the cationic 2D PAGEs are highly reproducible and superior in separating membrane as well as membrane-associated proteins than the classical 2D IEF/SDS PAGE approach. In gels of the cationic PAGEs, several proteins were identified that might interact with the cytoskeleton or with the membrane of the host cell. Some of these proteins belong to the rhoptries and the maurer`s clefts of the parasite or represent proteins that are still uncharacterized. In an additional 1D SDS PAGE, combined with LC-MALDI TOF/TOF, 733 parasite-derived proteins were identified. From these, 45 % are annotated as exported proteins, membrane proteins or uncharacterized proteins, which show the effectiveness of the applied method. By use of fluorescence-activated cell sorting, a method for the enrichment of early-infected erythrocytes was established. Using this method, an enrichment of up to 98 % was achieved, and the parasites within the sorted erythrocytes remained viable. The host cell membrane was then isolated according to the protocol established for late stage-infected erythrocytes. Three plasmodial proteins were found in the gel of a first 2D CTAB/SDS PAGE. These proteins are probably exported to the host cell directly after invasion to assure the survival and development of the parasite within its host cell. The comparison of gels from different stages of the parasite clearly showed significant differences in the protein repertoire, which shows the need for stage-specific analysis of the parasite to better understand parasite induced host-cell mofifications. In conclusion, the data of this work form the basis for further analyses of yet uncharacterized proteins identified in the gels of early-infected as well as late-infected erythrocytes. The characterization of these proteins may contribute to better understand the modification of the host cell and the interaction between the parasite and the host cell at the molecular level