A potential diagnostic biomarker: Proteasome LMP2/b1i-differential expression in human uterus neoplasm

Uterine leiomyosarcoma (ULMS) develops more often in the muscle tissue layer of the uterine body than in the uterine cervix. The development of gynecologic tumors is often correlated with female hormone secretion; however, the development of uterine ULMS is not substantially correlated with hormonal conditions, and the risk factors are not yet known. Importantly, a diagnostic-biomarker which distinguishes malignant ULMS from benign tumor leiomyoma (LMA) is yet to be established. Accordingly, it is necessary to analyze risk factors associated with uterine ULMS, to establish a treatment method. Proteasome low-molecular mass polypeptide 2(LMP2)/b1i-deficient mice spontaneously develop uterine LMS, with a disease prevalence of ~40% by 14 months of age. We found LMP2/b1i expression to be absent in human LMS, but present in human LMA. Therefore, defective-LMP2/b1i expression may be one of the risk factors for ULMS. LMP2/b1i is a potential diagnostic-biomarker for uterine ULMS, and may be a targeted-molecule for a new therapeutic approach

Il "targeting" del sindecano-1, molecola coinvolta nel processo di "vasculogenic mimicry", potenzia l' efficacia terapeutica dell' immunocitochina L19-IL2 in un modello sperimentale murino di melanoma umano.

La terapia anti-angiogenica nei tumori solidi finora non ha condotto ai benefici clinici desiderati, probabilmente a causa della complessità del processo neo-angiogenico, uno dei meccanismi che sta alla base della crescita dei tumori solidi. Un ruolo importante è svolto dalla “vasculogenic” o “vascular” mimicry (VM), un fenomeno in cui le cellule tumorali più aggressive sono in grado di formare una rete vascolare alternativa, indipendente dal processo di neo-angiogenesi che coinvolge le cellule endoteliali. In questo studio abbiamo osservato che in linee cellulari di melanoma umano con fenotipo vascolare e caratteristiche di staminalità e in tumori di melanoma umano si ha la co-espressione del sindecano-1 con marcatori di VM, come le molecole CD144 e VEGFR-2. Abbiamo dimostrato tramite esperimenti in vitro che utilizzando l’ anticorpo ricombinante umano OC-46F2, specifico per il sindecano-1, le cellule di melanoma umano perdono la loro capacità di formare strutture tubulari simil-vascolari. E’ stato inoltre osservato che in un modello sperimentale di melanoma umano indotto in topi NOD-SCID la terapia combinata, utilizzando l’ anticorpo umano ricombinante OC-46F2 e l’ immunocitochina L19-IL2, specifica per l’ isoforma EDB della fibronettina (B-FN), ha avuto come effetto la completa inibizione della crescita tumorale nel 71% dei topi trattati fino al giorno 90 dall'impianto del tumore con differenze statisticamente significative rispetto ai gruppi trattati con OC-46F2 o L19-IL2 come monoterapia. Inoltre, nei tumori espiantati da topi trattati con OC-46F2 come monoterapia o in combinazione con L19-IL2, abbiamo osservato una drastica diminuzione della densità vascolare e la perdita di strutture tubulari simil-vascolari. Questi risultati per la prima volta conferiscono al sindecano-1 un ruolo nella “vasular mimicry” del melanoma e indicano che il “targeting” del sindecano-1 combinato alla B-FN potrebbe essere una terapia molto promettente per migliorare il trattamento del melanoma metastatico umano. Anti-angiogenic therapy of solid tumors has until now failed to produce the long lasting clinical benefits desired, possibly due to the complexity of the neoangiogenic process. Indeed, a prominent role is played by “vasculogenic” or “vascular” mimicry (VM), a phenomenon in which aggressive cancer cells form an alternative microvascular circulation, independently of endothelial cell angiogenesis. In this study we observed, in melanoma patient cell lines having vasculogenic/stem-cell like phenotype and in melanoma tumors, the syndecan-1 co-expression with VM markers, such as CD144 and VEGFR-2. We show that melanoma cells lose their ability to form tubule-like structures in vitro after blocking syndecan-1 activity by the specific human recombinant antibody, OC-46F2. Moreover, in a human melanoma xenograft model, the combined therapy using OC-46F2 and L19-IL2, an immunocytokine specific for the tumor angiogenic-associated B-fibronectin isoform, led to a complete inhibition of tumor growth until day 90 from tumor implantation in 71% of treated mice, with statistically significant differences compared to groups treated with OC-46F2 or L19-IL2 as monotherapy. Furthermore, in the tumors recovered from mice treated with OC-46F2 either as monotherapy or in combination with L19-IL2, we observed a dramatic decrease of vascular density and loss of VM structures. These findings indicate for the first time a role of syndecan-1 in melanoma VM and that targeting syndecan-1, together with B-FN, could be promising in improving the treatment of metastatic melanoma

Livelli sierici di fattori pro-angiogenici e angiostatici nella sclerosi sistemica

La sclerodermia o sclerosi sistemica progressiva (SSc) è una malattia cronica e progressiva del tessuto connettivo, ad eziologia multifattoriale e patogenesi autoimmune, caratterizzata da alterazioni del sistema immunitario, disfunzione endoteliale e progressivo accumulo di tessuto fibroso a carico della cute e degli organi interni. Alterazioni funzionali e strutturali dei vasi con conseguente rimodellamento della parete endoteliale sono dimostrati già nelle fasi iniziali della SSc. Tali alterazioni sembrano essere responsabili dei cambiamenti del microcircolo con successiva perdita dei capillari e comparsa di aree avascolari. Studi sui fattori pro-angiogenici ed angiostatici in corso di SSc hanno spesso riportato risultati discordanti, in particolare quelli relativi ai dosaggi sierici di VEGF, FGF-2 ed endostatina. Lo scopo dello studio e’ quello di valutare in un ampio gruppo di pazienti con SSc i livelli circolanti di fattori pro-angiogenici (VEGF, FGF-2) ed angiostatici (Endostatina, TSP-1), di marcatori circolanti di disregolazione endoteliale (sICAM-1) ed il loro potenziale ruolo nella malattia. Abbiamo studiato 41 pazienti con SSc, caratterizzati dal punto di vista clinico, sierologico e strumentale. Nel siero di tali pazienti abbiamo dosato, mediante metodica immunoenzimatica, VEGF, FGF-2, endostatina, TSP-1 ed sICAM-1 e ne abbiamo confrontato i livelli con quelli dosati in 31 soggetti sani. Nel nostro studio i pazienti con SSc presentavano livelli dei fattori pro-angiogenici VEGF ed FGF-2 sovrapponibili a quelli dei controlli. Tra i fattori angiostatici abbiamo riscontrato nel siero dei pazienti con SSc livelli significativamente aumenti di endostatina ma non di TSP-1. I pazienti con SSc presentano livelli significativamente aumentati di sICAM-1 rispetto a quelli dei soggetti di controllo. All’ interno del gruppo dei pazienti con SSc non abbiamo riscontrato differenze significative di sICAM-1, ne’ di endostatina tra la forma diffusa e limitata. Nel nostro studio i livelli sierici di sICAM-1 correlano positivamente con i valori della VES e della PCR e i livelli di endostatina con la riduzione del complemento (C4). Dei 41 pazienti studiati 24 sono stati inoltre sottoposti ad indagine ultrasonografica transtoracica per quantificare la severità della fibrosi polmonare attraverso l’identificazione di comete ultrasoniche polmonari. Nel nostro studio il numero di comete correla positivamente con i valori di DLCO ed e’ significativamente ridotto nel gruppo ACA positivo rispetto al gruppo ACA negativo. In conclusione, nei pazienti con SSc abbiamo riscontrato un’ alterazione del fattore angiostatico endostatina e una disregolazione endoteliale. Inoltre da indagini strumentali non invasive quale l’ecografia transtoracica e’ stato possibile identificare una correlazione tra le comete ultrasonografiche e parametri di interstiziopatia polmonare (DLCO)

Sviluppo di una micro CT con sorgente Quasi-Monocromatica Multi-Energy per lo studio in vivo della crescita e della metastasi tumorale

Un innovativo micro scanner CT per piccolo animali – basato su di una sorgente che genera una coppia di fasci X Quasi-Monocromatici paralleli con diverse energie selezionabili – è in corso di installazione e caratterizzazione al Dipartimento di Fisica dell’Università di Bologna. Lo scopo della ricerca è quello di effettuare l’imaging radiologico in vivo del tessuto tumorale e/o dei pattern di neo-angiogenesi in una fase diagnostica precoce realizzando la separazione del tessuto patologico da quello sano per mezzo della tecnica multi-energy che consiste nell’utilizzo di due o più fasci di raggi X quasi-monocromatici in sostituzione dell’unico fascio policromatico utilizzato nella radiologia convenzionale. Lo strumento consentirà inoltre lo studio, sui topi, della crescita tumorale e della formazione delle metastasi per differenti tipologie di tumore. Per la diagnosi precoce del tumore è essenziale essere in grado di rivelare i cambiamenti tissutali precancerosi, come la neo-angiogenesi. Si tratta di un meccanismo che si verifica in una fase iniziale dello sviluppo della patologia ed è dovuto alla produzione di molecole che stimolano la creazione di nuovi vasi sanguigni per alimentare la crescita delle cellule cancerose. Come dimostrato in precedenti studi di fattibilità [1], un sistema di imaging basato su due fasci di raggi X quasi-monocromatici di differenti energie fornisce maggiore sensibilità nella rivelazione di basse concentrazioni di mezzo di contrasto iodato rispetto ai tradizionali apparati RX con fascio policromatico. La K-edge dual energy radiology è una tecnologia potenzialmente in grado di rivelare il processo di neo-angiogenesi tumorale in uno stadio precoce quando la strumentazione convenzionale non dispone di sufficiente sensibilità. Inoltre, la possibilità di selezionare le energie dei fasci quasi-monocromatici consente l’applicazione della Multi-Energy Quasi-MonochromaticRadiology: selezionando opportunamente le energie è possibile esaltare le differenze fra i coefficienti di attenuazione lineare del tessuto patologico rispetto a quello sano aumentando il contrasto della patologia. Infatti, la tecnica multi-energy consente di ricostruire il numero atomico efficace e persino la composizione chimica del tessuto irradiato. Tuttavia, per ottenere questo risultato, si dovrebbero conoscere le bande di energia in cui l’assorbimento dei raggi X da parte del tessuto tumorale eventualmente differisce significativamente da quello dei tessuti sani. Per questo motivo è stata iniziata una sistematica caratterizzazione radiologica di molti tipi di tessuti sani e neoplastici, murini e umani allo scopo di costituire un catalogo delle finestre di energia in cui sarà possibile applicare la metodica multi-energy

VARIAZIONE DI MARKERS MOLECOLARI IN PAZIENTI CON ANEURISMA CEREBRALE

Titolo della tesi: Variazione di marker molecolari in pazienti con aneurisma cerebrale Introduzione. INTRODUZIONE L¡¯aneurisma ¨¨ una patologia dell¡¯apparato vascolare che si manifesta come una dilatazione abnorme di un vaso che pu¨° colpire qualsiasi vena o arteria del corpo. In particolare un aneurisma cerebrale ¨¨ localizzato nel punto di biforcazione delle arterie cerebrali che costituiscono il poligono di Willis; la sua insorgenza pu¨° dipendere da fattori congeniti o acquisiti. La prima manifestazione clinica, nella maggior parte dei casi ¨¨ rappresentata da un¡¯emorragia, dovuta alla rottura della parete dei vasi, a livello dello spazio subaracnoideo. Studi condotti su pazienti affetti da tale patologia hanno evidenziato la presenza di fenomeni infiammatori associati a variazioni di marker biologici specifici sia in campioni tissutali che plasmatici. La componente infiammatoria ¨¨ associata a fenomeni di rimodellamento della parete vasale, in particolare a livello della tonaca media. SCOPO DEL LAVORO Lo studio, effettuato in collaborazione con la clinica di Neurochirurgia dell¡¯Ospedale ¡°Santa Chiara¡± di Pisa, prevede la valutazione del coinvolgimento di alcuni markers biologici nello sviluppo dell¡¯aneurisma cerebrale e le possibili interazioni tra i markers coinvolti. MATERIALI E METODI I volontari appartengono ai seguenti gruppi sperimentali: Controllo (n=10), Aneurisma non sanguinante (n=10) e Aneurisma sanguinante (n=16). I campioni di plasma prelevati sono stati utilizzati per la valutazione della concentrazione dei markers biologici (MMP-9, TIMP-1, IL-1¦Â, IL-18 e VEGF) attraverso l¡¯utilizzo di saggi immunoenzimatici (ELISA-sandwich). RISULTATI I livelli di MMP-9 aumentano significativamente sia nel gruppo con aneurisma non sanguinante (223.38 ¡À 31.6 vs 92.8 ¡À 21.7 ng/ml con p < 0.01) rispetto al controllo sia nel gruppo con aneurisma sanguinante (304.16 ¡À 48.6 vs 92.8 ¡À 21.7 ng/ml con p < 0.05). Non si ¨¨ invece osservata una significativa differenza tra i gruppi con aneurisma sanguinante e non sanguinante. I livelli plasmatici del TIMP-1 rimangono pressoch¨¦ invariati nei tre gruppi presi in esame: nel gruppo controllo si ha una media di 120.17 ng/ml (SD = 15.21), nel gruppo con aneurisma non sanguinante la media ¨¨ di 135.73 ng/ml (SD = 21.91) mentre nel gruppo con aneurisma sanguinante ¨¨ di 128.69 ng/ml (SD = 13.37). Nel rapporto MMP-9/TIMP-1 si ha un aumento significativo rispetto al gruppo controllo, sia nel gruppo dell¡¯aneurisma non sanguinante (3.27 ¡À 0.76 vs 0.96 ¡À 0.33 ng/ml con p < 0.01) che nel gruppo dell¡¯aneurisma sanguinante (3.38 ¡À 0.63 vs 0.96 ¡À 0.33 ng/ml con p < 0.05). Non vi ¨¨ invece differenza significativa tra il gruppo con aneurisma non sanguinante e quello con aneurisma sanguinante. I livelli di IL-1¦Â mostrano un aumento significativo di tale parametro rispetto al controllo sia nel gruppo con aneurisma non sanguinante (74.5 ¡À 21.27 vs 19.67 ¡À 3.78 pg/ml con p < 0.05) che nel gruppo con aneurisma sanguinante (58.06 ¡À 16.5 vs 19.67 ¡À 3.78 pg/ml con p < 0.05). Non vi ¨¨ invece differenza significativa tra il gruppo con aneurisma non sanguinante e quello con aneurisma sanguinante (p = 0.053). I livelli di IL-18 non evidenziano un aumento significativo rispetto al gruppo controllo, sia nel gruppo con aneurisma non sanguinante (215.6 ¡À 55.96 vs 104.8 ¡À 21.80 pg/ml con p = 0.065) che nel gruppo con aneurisma sanguinante (305.4 ¡À 95.48 vs 104.8 ¡À 21.80 pg/ml con p = 0.075). Non vi ¨¨ invece differenza significativa tra il gruppo con aneurisma non sanguinante e quello con aneurisma sanguinante. Infine i livelli di VEGF hanno mostrato un aumento significativo di tale parametro sia nel gruppo con aneurisma non sanguinante (45.60 ¡À 6.03 vs 26.08 ¡À 4.86 pg/ml con p < 0.01) che nel gruppo con aneurisma sanguinante (94.71 ¡À 36.18 vs 26.08 ¡À 4.86 pg/ml con p < 0.05) rispetto al controllo. Non vi ¨¨ invece differenza significativa tra il gruppo con aneurisma non sanguinante e quello con aneurisma sanguinante. Sono state inoltre osservate delle correlazioni tra i markers indagati: L¡¯IL-1¦Â ha evidenziato una correlazione positiva significativa con l¡¯MMP-9 (p = 0.00215) e non significativa con il VEGF (p = 0.28). L¡¯IL-18 ha una correlazione positiva significativa con l¡¯MMP-9 (p = 0.0024) e con l¡¯IL-1¦Â (p = 0.0017) e non significativa con VEGF (p = 0.62). Infine il VEGF presenta una correlazione positiva significativa solo con l¡¯MMP-9 (p = 0.011). CONCLUSIONI Sulla base dei dati emersi da questo studio ¨¨ possibile affermare che tra i meccanismi maggiormente coinvolti nello sviluppo di un aneurisma vi ¨¨ l¡¯aumento di citochine proinfiammatorie e l¡¯upregulation del sistema dell¡¯MMP, si pu¨° inoltre ipotizzare l¡¯esistenza di segnali precoci la cui espressione viene downregolata con il procedere della patologia. Infine, possibili fattori coinvolti nello sviluppo dell¡¯aneurisma sono molecole ad attivit¨¤ modulatoria e proinfiammatoria indiretta come IL-18

Possibili meccanismi post trascrizionali implicati nella regolazione dell’ormone leptina.

Il gene ob codifica per la leptina, un ormone-citochina prodotto prevalentemente dal tessuto adiposo bianco (WAT) e considerato un importante segnale di sazietà: da cui il nome della proteina che deriva dal greco “lepthos”, magro. Mutanti spontanei di topo, deficienti per questo ormone, sviluppano una obesità grave in fasi molto precoci della vita. La leptina viene secreta in proporzione alla massa grassa totale e i suoi recettori sono stati individuati in nuclei ipotalamici implicati nella regolazione del bilancio energetico e di comportamenti associati alla nutrizione. L'innalzamento dei livelli plasmatici dell’ormone, causa l'attivazione di un pathway neuronale che determina una risposta anoressizante, mentre una loro diminuzione induce una risposta contraria. La leptina è interessata anche in altri processi, quali: maturazione dell’apparato riproduttivo e del sistema immunitario, angiogenesi, omeostasi del tessuto osseo, processi infiammatori. L'espressione della leptina è regolata da diverse condizioni croniche come: lo stato nutrizionale, l'eta' , il sesso e da stimoli acuti quali citochine, ipossia, beta-3agonisti, glucocorticoidi, insulina. I processi molecolari che stanno alla base di alcune di queste regolazioni non sono stati ancora chiariti. Non sono ad esempio noti elementi attivi in cis nella regione 5'-UTR del gene della leptina, che possano giustificare una regolazione da parte dell'insulina o dei glucocorticoidi. Gli elementi regolativi potrebbero quindi essere situati altrove, ad esempio nella lunga regione 3’ non tradotta (3’ UTR, circa 2700 basi) di quest’ormone che costituisce più dell’80% della lunghezza dell’intero messaggero. La regione 3' UTR di alcuni trascritti è ritenuta un elemento essenziale nella modulazione della stabilita' (emivita) degli stessi e della loro accessibilita' da parte del macchinario traduzionale; tali meccanismi sono chiaramente rilevanti nella modulazione della produzione proteica. Nei vertebrati, meccanismi di questo tipo, sono attivi ad esempio durante lo sviluppo embrionale di Xenopus e di topo e nel contesto di alcune funzioni apprendimento dipendenti in neuroni adulti. In generale si tratta di sistemi che consentono il mantenimento di trascritti "dormienti" (non tradotti) in distretti subcellulari e la loro "attivazione traduzionale" in seguito a precisi stimoli. La regolazione della lunghezza della regione 3'-UTR di questi trascritti attraverso un allungamento inducibile, a livello citoplasmatico, della coda di adenosine aggiunta in fase di maturazione nucleare dei trascritti, è stata messa in relazione con la loro attivazione traduzionale. Le tipologie cellulari interessate da questi meccanismi, sono accumunate da una estrema polarizzazione strutturale e molecolare. Tali sistemi di regolazione non sono mai stati descritti negli adipociti, ne’ studiati in relazione alla leptina. Tuttavia è noto, che nella 3’UTR di altre citochine sono presenti elementi consensus per il legame con proteine che regolano la stabilità e quindi l’ emivita dell’mRNA. Tali elementi sono caratterizzati da sequenze ricche in adenosine e uridine (A+U rich elements, AREs) e possono essere implicati nei processi di poliadenilazione citoplasmatica. Scopo della mia tesi è stato quello di stabilire se la regione 3’UTR della leptina possa essere implicata nella regolazione della produzione dell’ormone, attraverso un meccanismo di poliadenilazione variabile del messaggero. Poiché non esisteva in banca dati un clone completo del gene murino della leptina, abbiamo utilizzato la 3’ RACE per isolare la parte terminale del gene. Il sequenziamento di tale regione ha mostrato la presenza di alcune AREs , in particolare sono stati identificati : un segnale di poliadenilazione (esanucleotide altamente conservato AAUAAA) e alcuni elementi detti di poliadenilazione citoplasmatica (CPE) caratterizzati dalla sequenza consensus UAUUUUU(U) . La presenza dell'elemento CPE ha fatto ipotizzare che il 3'-UTR del trascritto della leptina potesse essere un target della proteina CPE-binding protein (CPEB), molecola precedentemente non caratterizzata negli adipociti, che gioca un ruolo chiave nei processi di regolazione della poliadenilazione citoplasmatica. La presenza di CPEB nel tessuto adiposo bianco, mai riportata fino a qui in letteratura, è stata da noi dimostrata sia tramite RT-PCR che analisi di Western Blot. Ci siamo quindi chiesti se il messaggero per la leptina subisse un allungamento variabile della coda di poliadenilazione e se questa potesse essere messa in relazione con la quantità di ormone prodotta. Si può evidenziare tale fenomeno con una paricolare tecnica di RT-PCR ancorata che, nel caso di una poliadenilazione variabile, dà luogo a dei prodotti di PCR visualizzabili su di un gel di agarosio come una banda principale con uno smear sovrastante. Questo è esattamente il pattern osservabile nel caso della leptina, utilizzando come materiale di partenza RNA estratto da tessuto adiposo bianco di topo. Il confronto tra topo geneticamente obeso, che sovraesprime l’ormone, e topo magro non ha tuttavia evidenziato differenze nella lunghezza o nell’aspetto dello smear; questo può essere messo in relazione con il fatto che i modelli utilizzati sono cronici e complessi. Per questo motivo abbiamo ritenuto opportuno valutare l’ allungamento della coda del messaggero per la leptina in un sistema più semplice, costituito da colture primarie di adipociti, trattate o meno con gli induttori della sintesi di leptina: insulina e dexametasone. La valutazione dei livelli dell’ormone rilasciato dagli adipociti nel mezzo di coltura tramite un saggio E.L.I.S.A. , ci ha permesso di verificare l’effetto positivo degli induttori utilizzati. Dati preliminari indicano che, soprattutto nei campioni trattati con l’insulina, si osserva una associazione positiva tra l’allungamento della coda di poliadenilazione e l’aumento di produzione di leptina. Con questo studio abbiamo quindi dimostrato che : 1. La regione 3’ non codificante del gene murino della leptina presenta elementi consensus per il legame con fattori che partecipano alla stabilizzazione dell’RNA maturo, in particolare si sono osservati elementi CPE. 2. Nel tessuto adiposo bianco di topo è presente almeno uno dei fattori che guidano la poliadenilazione citoplasmatica dei messaggeri, ovvero la proteina CPEB. 3. Il messaggero della leptina subisce una poliadenilazione variabile in vivo ed in vitro 4. L’insulina sembra modulare l’allungamento della coda in dipendenza della sua capacità di induzione sulla produzione di leptin

Diabetes and Critical Limb Ischemia. Evaluation of Serological Vascular damage markers: quantitative determination of circulating mature endothelial cells

OBIETTIVO : Quantificare le CECs/ml nei pazienti affetti da ischemia critica (IC) degli arti inferiori, eventuali correlazioni tra i fattori di rischio, lo stadio clinico con l’ aumento delle CECs. Valutare i cambiamenti strutturali (calcificazione ed infiltratto infiammatorio) e l’ angiogenesi (numero di capillari /sezione) della parete arteriosa. MATERIALI E METODI: Da Maggio 2006 ad Aprile 2008 in modo prospettico abbiamo arruolato paziente affetti da IC da sottoporre ad intervento chirurgico. In un data base abbiamo raccolto : caratteristiche demografiche, fattori di rischio, stadiazione dell'IC secondo Leriche-Fontaine (L-F), il tipo di intervento chirurgico. Per ogni paziente abbiamo effettuato un prelievo ematico di 2 ml per la quantificazione immunomagnetica delle CECs e prelievo di parete arteriosa. RISULTATI: In modo consecutivo abbiamo arruolato 33 pazienti (75.8% maschi) con età media di 71 aa (range 34-91aa), affetti da arteriopatia ostruttiva cronica periferica al IV stadio di L-F nel 84.8%, da cardiopatia ischemica cronica nel 60.6%, da ipertensione arteriosa nel 72.7% e da diabete mellito di II tipo nel 66.6%. Il valore medio di CECs/ml è risultato significativamente più elevato (p= 0.001) nei soggetti affetti da IC (CECs/ml =531.24 range 107- 3330) rispetto ai casi controllo (CECs/ml = 125.8 range 19-346 ). Le CECs/ml nei pazienti diabetici sono maggiori rispetto alle CECs/ml nei pazienti non diabetici ( 726.7 /ml vs 325.5/ml ), p< 0.05 I pazienti diabetici hanno presentato maggior incidenza di lesioni arteriose complesse rispetto ai non diabetici (66% vs 47%) e minor densità capillare (65% vs 87%). Conclusioni : Le CECs sono un marker sierologico attendibile di danno vascolare parietale, la loro quantità è maggiore nei pazienti diabetici e ipertesi. La minor capacità angiogenetica della parete arteriosa in presenza di maggior calcificazioni ed infiltrato infiammatorio nei diabetici, dimostra un danno istopatologico di parete maggiore .OBJECTIVE: To quantify the number of circulating endothelial mature cells (EMC) in patients with critical limb ischemia (CI), and if correlations exit with risk factors, clinical stage and the number of cEMC. Evaluate the vascular structure changes (calcification and inflammatory infiltrate) and angiogenesis (number of capillary/arterial slice) of arterial wall. METHODS: Between 2006, may, and 2008, april, we’ve enrolled in a prospective study patients with CI scheduled for surgery. Demographic data, risk factors, clinical stage according to Leriche-Fontaine, type of surgery have been collected and stored in a database. For every patient 2 ml of blood have been sampled for immunomagnetic quantification of cEMC, so as a sample of the arterial wall. RESULTS: Thirtythree patients (25 males, 75,8%), aged 34-91, average 71years old, with CI underwent surgical revascularization have been enrolled. Twentyeight patients (84.8%) had a IV stage PAOD, chronic heart ischemia (60.6%), hypertension (72.7%) and diabetes mellitus type II (66.6%). The average concentration of cEMC/ml is significant higher (p=0.001) in patients with CI (cEMC=531.24, range 107-3330) than in control cases (cEMC =125.8, range 19-346). Also patients with diabetes type II have a higher concentration of cEMC than the non-diabetic patients (726.7/mm vs 325.5/ml vs.), with a p<0.05. Arterial wall of pts. with diabetes , compared with control group, revealed a higher incidence of complex arterial lesions (66% vs. 47%) and a lower capillary density (65% vs. 87%). CONCLUSION: cEMC are a reliable marker of vascular wall damage. Their concentration is higher in patients with diabetes, hypertensive disease. In patients with diabetes type 2 we’ve found a minor angiogenic capability with more calcifications and inflammatory infiltrate, showing a more serious damag