Normal hearing function genetics: have you heard all about it? An integrated approach of genome-wide association studies and transcriptome-wide association studies in three Italian cohorts

Introduction: Deepening the genetic mechanisms underlying Normal Hearing Function (NHF) has proven challenging, despite extensive efforts through Genome-Wide Association Studies (GWAS). Methods: NHF was described as a set of nine quantitative traits (i.e., hearing thresholds at 0.25, 0.5, 1, 2, 4, and 8 kHz, and three pure-tone averages of thresholds at low, medium, and high frequencies). For each trait, GWAS analyses were performed on the Moli-sani cohort (n = 1,209); then, replication analyses were conducted on Carlantino (CAR, n = 261) and Val Borbera (VBI, n = 425) cohorts. Expression levels of the most significantly associated genes were assessed employing single-nucleus RNA sequencing data (snRNA-seq) on human fetal and adult inner ear tissues. Finally, for all nine NHF traits, Transcriptome-Wide Association Studies (TWAS) were performed, combining GWAS summary statistics and pre-computed gene expression weights in 12 brain tissues. Results: GWAS on the Discovery cohort allowed the detection of 667 SNPs spanning 327 protein coding genes at a p < 10−5, across the nine NHF traits. Two loci with a p < 5 × 10−8 were replicated: 1. rs112501869 within SLC1A6 gene, encoding a brain high-affinity glutamate transporter, reached p = 6.21 × 10−9 in the 0.25 kHz trait. 2. rs73519456 within ASTN2 gene, encoding the Astrotactin protein 2, reached genome-wide significance in three NHF traits: 0.5 kHz (p = 1.86 × 10−8), PTAL (p = 9.40 × 10−9), and PTAM (p = 3.64 × 10−8). SnRNA-seq data analyses revealed a peculiar expression of the ASTN2 gene in the neuronal and dark cells populations, while for SLC1A6 no significant expression was detected. TWAS analyses detected that the ARF4-AS1 gene (eQTL: rs1584327) was statistically significant (p = 4.49 × 10−6) in the hippocampal tissue for the 0.25 kHz trait. Conclusion: This study took advantage of three Italian cohorts, deeply characterized from a genetic and audiological point of view. Bioinformatics and biostatistics analyses allowed the identification of three novel candidate genes, namely, SLC1A6, ASTN2, and ARF4-AS1. Functional studies and replication in larger and independent cohorts will be essential to confirm the biological role of these genes in regulating hearing function; however, these results confirm GWAS and TWAS as powerful methods for novel gene discovery, thus paving the way for a deeper understanding of the entangled genetic landscape underlying the auditory system

Normal hearing function genetics: have you heard all about it?: An integrated approach of genome-wide association studies and transcriptome-wide association studies in three Italian cohorts

Introduction: Deepening the genetic mechanisms underlying Normal Hearing Function (NHF) has proven challenging, despite extensive efforts through Genome-Wide Association Studies (GWAS). Methods: NHF was described as a set of nine quantitative traits (i.e., hearing thresholds at 0.25, 0.5, 1, 2, 4, and 8 kHz, and three pure-tone averages of thresholds at low, medium, and high frequencies). For each trait, GWAS analyses were performed on the Moli-sani cohort (n = 1,209); then, replication analyses were conducted on Carlantino (CAR, n = 261) and Val Borbera (VBI, n = 425) cohorts. Expression levels of the most significantly associated genes were assessed employing single-nucleus RNA sequencing data (snRNA-seq) on human fetal and adult inner ear tissues. Finally, for all nine NHF traits, Transcriptome-Wide Association Studies (TWAS) were performed, combining GWAS summary statistics and pre-computed gene expression weights in 12 brain tissues. Results: GWAS on the Discovery cohort allowed the detection of 667 SNPs spanning 327 protein coding genes at a p < 10(-5), across the nine NHF traits. Two loci with a p < 5 x 10(-8) were replicated: 1. rs112501869 within SLC1A6 gene, encoding a brain high-affinity glutamate transporter, reached p = 6.21 x 10(-9) in the 0.25 kHz trait. 2. rs73519456 within ASTN2 gene, encoding the Astrotactin protein 2, reached genome-wide significance in three NHF traits: 0.5 kHz (p = 1.86 x 10(-8)), PTAL (p = 9.40 x 10(-9)), and PTAM (p = 3.64 x 10(-8)). SnRNA-seq data analyses revealed a peculiar expression of the ASTN2 gene in the neuronal and dark cells populations, while for SLC1A6 no significant expression was detected. TWAS analyses detected that the ARF4-AS1 gene (eQTL: rs1584327) was statistically significant (p = 4.49 x 10(-6)) in the hippocampal tissue for the 0.25 kHz trait. Conclusion: This study took advantage of three Italian cohorts, deeply characterized from a genetic and audiological point of view. Bioinformatics and biostatistics analyses allowed the identification of three novel candidate genes, namely, SLC1A6, ASTN2, and ARF4-AS1. Functional studies and replication in larger and independent cohorts will be essential to confirm the biological role of these genes in regulating hearing function; however, these results confirm GWAS and TWAS as powerful methods for novel gene discovery, thus paving the way for a deeper understanding of the entangled genetic landscape underlying the auditory system.Disorders of the head and nec

Genetic correlations among psychiatric and immune-related phenotypes based on genome-wide association data

Individuals with psychiatric disorders have elevated rates of autoimmune comorbidity and altered immune signaling. It is unclear whether these altered immunological states have a shared genetic basis with those psychiatric disorders. The present study sought to use existing summary-level data from previous genome-wide association studies to determine if commonly varying single nucleotide polymorphisms are shared between psychiatric and immune-related phenotypes. We estimated heritability and examined pair-wise genetic correlations using the linkage disequilibrium score regression (LDSC) and heritability estimation from summary statistics methods. Using LDSC, we observed significant genetic correlations between immune-related disorders and several psychiatric disorders, including anorexia nervosa, attention deficit-hyperactivity disorder, bipolar disorder, major depression, obsessive compulsive disorder, schizophrenia, smoking behavior, and Tourette syndrome. Loci significantly mediating genetic correlations were identified for schizophrenia when analytically paired with Crohn's disease, primary biliary cirrhosis, systemic lupus erythematosus, and ulcerative colitis. We report significantly correlated loci and highlight those containing genome-wide associations and candidate genes for respective disorders. We also used the LDSC method to characterize genetic correlations among the immune-related phenotypes. We discuss our findings in the context of relevant genetic and epidemiological literature, as well as the limitations and caveats of the study.</p

Genetic correlations among psychiatric and immune-related phenotypes based on genome-wide association data

Individuals with psychiatric disorders have elevated rates of autoimmune comorbidity and altered immune signaling. It is unclear whether these altered immunological states have a shared genetic basis with those psychiatric disorders. The present study sought to use existing summary-level data from previous genome-wide association studies to determine if commonly varying single nucleotide polymorphisms are shared between psychiatric and immune-related phenotypes. We estimated heritability and examined pair-wise genetic correlations using the linkage disequilibrium score regression (LDSC) and heritability estimation from summary statistics methods. Using LDSC, we observed significant genetic correlations between immune-related disorders and several psychiatric disorders, including anorexia nervosa, attention deficit-hyperactivity disorder, bipolar disorder, major depression, obsessive compulsive disorder, schizophrenia, smoking behavior, and Tourette syndrome. Loci significantly mediating genetic correlations were identified for schizophrenia when analytically paired with Crohn's disease, primary biliary cirrhosis, systemic lupus erythematosus, and ulcerative colitis. We report significantly correlated loci and highlight those containing genome-wide associations and candidate genes for respective disorders. We also used the LDSC method to characterize genetic correlations among the immune-related phenotypes. We discuss our findings in the context of relevant genetic and epidemiological literature, as well as the limitations and caveats of the study.</p

Μελέτη της συνεισφοράς του RNA πατρικής προέλευσης στα πρώιμα στάδια ανάπτυξης του γονιμοποιημένου ωαρίου

Η τροποποίηση της γονιδιακής έκφρασης καθίσταται αναγκαία κατά τη γονιμοποίηση, την προεμφυτευτική ανάπτυξη και την εμφύτευση των βλαστοκύστεων στο ενδομήτριο. Η είσοδος του σπερματοζωαρίου συνεισφέρει στο ζυγωτό μεταξύ άλλων το πατρικό γονιδιώμα, το κεντροσωμάτιο και πατρικά RNA μόρια/παράγοντες. Πατρικά μικρά RNA μόρια έχουν συνδεθεί με τη διαγενεακή επιγενετική κληρονομικότητα, ενώ ένας τουλάχιστον γνωστός πατρικός παράγοντας, PLC-ζ, είναι αναγκαίος για την ενεργοποίηση του μεταβολισμού του ωαρίου. Σημαντικές λειτουργίες που λαμβάνουν χώρα στο ζυγωτό, αποτελούν η αποικοδόμηση παραγόντων μη αναγκαίων για την ανάπτυξη του εμβρύου και η ενεργοποίηση της έκφρασης στο εμβρυϊκό γονιδίωμα. Η μακρά διάρκεια της πρώτης μιτωτικής διαίρεσης του γονιμοποιημένου ωαρίου (ποντίκι) προσφέρει αρκετό χρόνο για την αλληλεπίδραση πατρικών και μητρικών μεταγράφων ή/και των αντίστοιχων πρωτεϊνών. Κατά τη διερεύνηση της πρώιμης εμβρυϊκής ανάπτυξης είναι σημαντικός ο προσδιορισμός της γονιδιακής έκφρασης του τροφεκτοδέρματος (πρώτα κύτταρα που έρχονται σε επαφή με το ενδομήτριο), για την κατανόηση κι ενδεχόμενη επιλογή των ικανών προς εμφύτευση εμβρύων. Η μελέτη της τροφεκτοδερμικής γονιδιακής έκφρασης σε συνδυασμό με την ικανότητα των εμβρύων να εμφυτεύονται στον άνθρωπο μελετήθηκε από 2 μελέτες, που όμως δεν ήταν επαρκείς για την αξιόπιστη ανάλυση των μικρών RNA ποσοτήτων των βιοψιών. Η παρούσα μελέτη χρησιμοποίησε πιο αξιόπιστες/στοχευμένες μεθοδολογίες με ταυτόχρονη διερεύνηση ανευπλοειδιών. Η ηλικία των γονέων έχει αντίκτυπο στα επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης ευπλοειδικών και μη βλαστοκύστεων, από το στάδιο του γονιμοποιημένου ωαρίου και καθ’όλη την προεμφυτευτική ανάπτυξη του εμβρύου. Η γήρανση είναι βιολογική διαδικασία εξέχουσας σημασίας που επηρεάζει την ομαλή ανάπτυξη των εμβρύων, αναδεικνύοντας μοριακούς παράγοντες σχετικούς με τη μητρική ηλικία και την ικανότητα του εμβρύου να εμφυτεύεται. Η μέθοδος της νέας γενιάς RNA αλληλούχισης του μεταγραφώματος χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση της πατρικής συνεισφοράς στο ζυγωτό. Για πρώτη φορά εφαρμόστηκε πανομοιότυπη ανάλυση τόσο σε μοριακό όσο και σε επίπεδο βιοπληροφορικής σε σπερματοζωάρια, ωάρια (μετάφασης ΙΙ) και ζυγωτά στο ποντίκι. Ακολούθησε ανάλυση γονιδιακών οντολογιών σε συνδυασμό με ένα νέο in silico σχεδιασμό, για την ανάδειξη πιθανών αλληλεπιδράσεων μεταξύ πατρικών και μητρικών παραγόντων στο ζυγωτό. Περαιτέρω μελέτη της προεμφυτευτικής ανάπτυξης του εμβρύου συμπεριέλαβε τροφεκτοδερμικά δείγματα βλαστοκύστεων που διαχωρίστηκαν βάσει εμφυτευσιμότητάς στο ενδομήτριο. Το προφιλ γονιδιακής έκφρασης μεμονωμένων βιοψιών αναλύθηκε με κύρια κριτήρια την εμφύτευση και την επίτευξη εγκυμοσύνης. Η ευαίσθητη μοριακή προσέγγιση που χρησιμοποιήθηκε, περιέλαβε την RNA αλληλούχιση νέας γενιάς μικρού αριθμού τροφεκτοδερμικών κυττάρων από βιοψία τροφεκτοδέρματος – μέθοδος που δεν επηρεάζει την έκβαση της εμφύτευσης. Παρόμοια πειραματική προσέγγιση ακολουθήθηκε για τη διερεύνηση του μεταγραφώματος των τροφεκτοδερμικών κυττάρων που διαχωρίστηκαν βάσει μητρικής ηλικίας, τα οποία έπειτα από μετα-ανάλυση του μεταγραφώματος των δεκτικών ενδομητρίων συνδυάστηκαν σε μια νέα μοριακή ανάλυση, έπειτα από ανάλυση ανευπλοειδιών. Η in silico ανάλυση γαμετών και ζυγωτών στα ποντίκια ανέδειξε γονιδιακές οντολογίες πατρικών μεταγράφων σχετικών με τον καθαρισμό/αποικοδόμηση RNA και πρωτεϊνών, και τη μετα-μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Ταυτόχρονα, αναδείχθηκαν συγκεκριμένοι παράγοντες πατρικής, μητρικής και εμβρυϊκής προέλευσης, που ενδέχεται να αλληλεπιδρούν ή/και να δρουν με συνεργατικό τρόπο κατά τη διαμόρφωση του ζυγωτού. Τουλάχιστον 5 πατρικά μετάγραφα κάλυπταν τα κριτήρια που τέθηκαν στην παρούσα μελέτη, συμπεριλαμβανομένης της αποακετυλάσης ιστονών Hdac11, του παράγοντα Fbxo2, του συνδεόμενου με μικροσωληνίσκους παράγοντα Map1lc3a, του Pcbp4 που συνδέεται με νουκλεικά οξέα και του δακτύλου ψευδαργύρου Zfp821. Οι παράγοντες αυτοί πιθανόν να βρίσκονται στο ζυγωτό στα πλαίσια της πατρικής συνεισφοράς, ενώ παρουσιάζουν αλληλεπιδράσεις με μητρικούς παράγοντες. Κατά την προεμφυτευτική ανάπτυξη των θηλαστικών, η ανάλυση των τροφεκτοδερμικών κυττάρων της βλαστοκύστης ανέδειξε 47 στατιστικά σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενα μετάγραφα από τη σύγκριση βλαστοκύστεων βάσει εμφυτευσιμότητας. Τα 36 μετάγραφα είχαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση στις εμφυτευθείσες βλαστοκύστες, συμπεριλαμβανομένης της αφυδρογονάσης HSD17B1 και του CYP11A1, μέλους της οικογένειας του κυτοχρώματος P450, ενώ τα υπόλοιπα 11 μετάγραφα είχαν σημαντικά χαμηλότερη έκφραση, όπως το προαποπτωτικό BAK1 και το ενδεχόμενο ψευδογονίδιο, KHDC1P1, που ανιχνεύθηκε στις βλαστοκύστες που δεν εμφυτεύθηκαν ενώ απουσίαζε από όλες τις εμφυτευθείσες βλαστοκύστες. Η ανάλυση γονιδιακών οντολογιών έδειξε μετάγραφα που συμμετείχαν στη στεροειδογένεση με μεγάλη στατιστική σημαντικότητα. Η σύγκριση των βλαστοκύσεων που κατηγοριοποιήθηκαν βάσει της μητρικής ηλικίας, ανέδειξε 182 στατιστικά σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενα μετάγραφα, 91 εκ των οποίων εκφράζονταν υψηλότερα στις βλαστοκύστες νεαρών γυναικών. Τα εξωσώματα αποτελούν στατιστικά σημαντική γονιδιακή οντολογία του τροφεκτοδέρματος των νεαρών γυναικών (FDR 2.6E-4). Σύμφωνα με την παρούσα μελέτη, τη βιβλιογραφία και μελέτες ποντικών, το μετάγραφο του προσαρμοστή κλαθρίνης DAB2, ο παράγοντας DBI που συνδέεται με το ακετυλοσυνένζυμο-Α και το σχετιζόμενο με τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο PDCD2 κ.α, ενδέχεται να αντικατοπτρίζουν εκτός της γήρανσης και την επιτυχή εμφύτευση της βλαστοκύστης. Συνδυασμός με το μεταγράφωμα του δεκτικού ενδομητρίου ανέδειξε τις διαδικασίες ρύθμισης της απόπτωσης και του MAPK μονοπατιού με πιθανή συσχέτιση με την εμφύτευση. Τέλος, το τροφοεκτόδερμα βρέθηκε να εκφράζει περίπου 180% περισσότερα πατρικά μετάγραφα από ότι θα αναμένονταν βάσει τυχαιότητας. Η κατανόηση της πατρικής συνεισφοράς στο ζυγωτό θα μπορούσε να ερμηνεύσει μηχανισμούς που διέπουν τη γονιμοποίηση του ωαρίου, με σκοπό την καλύτερη διάγνωση και θεραπεία της ανδρικής υπογονιμότητας μέσω στοχοποίησης νέων μοριακών βιοδεικτών. Παρόμοια μεθοδολογική προσέγγιση θα μπορούσε να εφαρμοστεί και στον άνθρωπο. Η μελέτη ανέδειξε ενδεχόμενους σημαντικούς μοριακούς δείκτες κατά τα προεμφυτευτικά στάδια ανάπτυξης του εμβρύου και των τροφεκτοδερμικών κυττάρων. Οι δείκτες αυτοί θα μπορούσαν να έχουν σημαντικό ρόλο στην ικανότητα των εμβρύων να εμφυτεύονται, αντικατοπτρίζοντας μοριακούς μηχανισμούς που ενδέχεται να συνδέονται με την επιτυχή εμβρυϊκή ανάπτυξη κι εμφύτευση. Η επίδραση της γήρανσης στην ικανότητα των βλαστοκύστεων να εμφυτεύονται λόγω τροποποποίησης του τροφεκτοδερμικού μεταγραφώματος, ανέδειξαν σημαντικές βιολογικές διεργασίες που υποδηλώνουν αφενός τη σημαντικότητα των σημάτων επιβίωσης προς τη βλαστοκύστη και αφετέρου την ανάγκη για διείσδυση της βλαστοκύστης στο ενδομήτριο ακριβώς όσο χρειάζεται. Οι πατρικοί, και μη, μοριακοί βιοδείκτες που βρέθηκαν μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη βελτίωση των ποσοστών γονιμοποίησης κι εμφύτευσης των βλαστοκύστεων σε επίπεδο διάγνωσης και θεραπείας υγιών γαμετών και εμβρύων, αυξάνοντας τις πιθανότητες επιτυχούς κύησης.During mammalian fertilisation and preimplantation embryo development, important gene expression alterations take place to promote successful embryo development and implantation. Paternal contributions to the zygote are thought to extend beyond delivery of the genome. Paternal RNAs have been linked to epigenetic transgenerational inheritance in different species. In addition, sperm-egg fusion activates several downstream processes that contribute to the zygote formation, including PLC zeta-mediated egg activation and maternal RNA clearance. Since a third of the preimplantation developmental period in the mouse occurs prior to the first cleavage stage, there is ample time for paternal RNAs or their encoded proteins potentially to interact and participate in early zygotic activities. The determination of gene expression alterations during early embryo development could assist in the selection of competent embryos for uterine transfer and improve implantation rates, given that trophectoderm biopsy does not affect implantation potential. Previous studies attempting to establish the relationship between trophectoderm gene expression profiles and implantation competency, were not sufficiently optimized to handle the exceptionally low RNA input available from biopsied material. Thus the current study used more accurate RNA sequencing approaches to address the low RNA amount. Ageing is an extremely crucial parameter that indirectly affects implantation and could reveal molecular factors involved in implantation potential. It has been found that parental age has an impact on euploid (and aneuploid) blastocyst gene expression levels, starting from the fertilised oocyte and throughout the development of the preimplantation embryo. To address the paternal contribution to the zygote at the transcriptome level, a bespoke next generation RNA sequencing pipeline was employed for the first time to characterise and compare transcripts obtained from isolated murine sperm, MII eggs and pre cleavage stage zygotes. Gene network analysis was then employed to identify potential interactions between paternally and maternally derived factors during the murine egg to zygote transition. Our preimplantation development approach on trophectoderm samples, included differential gene expression analysis between human competent and incompetent trophectoderm samples assayed by an ultra-sensitive next generation RNA sequencing strategy. Gene expression profiles from isolated human trophectoderm cells were analysed with the established clinical pregnancy being the primary endpoint. A similar methodological approach was employed in a more complex design to assess the transcriptome of the trophectoderm cells that derived from young and advanced maternal age women. These biomarkers were analysed for aneuploidies and combined with publically available endometrial data to understand their interactions. Our in silico approach identified gene ontologies involved in RNA and protein clearance, along with other potential post-transcriptional regulations, and looked for factors in sperm, eggs and zygotes that could potentially interact co-operatively and synergistically during the zygote formation. At least five sperm transcripts, including histone deacetylase Hdac11, F-box transcript Fbxo2, microtubule associated protein Map1lc3a, the poly(RC) binding protein Pcbp4 and the zinc finger Zfp821, met the requirements for paternal contribution, which suggest a wider potential for extra-genomic paternal involvement in the developing zygote with complementary maternal co-factors. Later in the mammalian preimplantation development, a total of 47 transcripts were found significantly differentially expressed between the trophectoderm of competent (implanted) and incompetent (non implanted) blastocysts. Of these, 36 transcripts were significantly up-regulated in the competent blastocysts, including Hydroxysteroid 17-Beta Dehydrogenase 1 (HSD17B1) and Cytochrome P450 Family 11 Subfamily A Member 1 (CYP11A1), while the remaining 11 transcripts were significantly down-regulated, including BCL2 Antagonist/Killer 1 (BAK1) and KH Domain Containing 1 Pseudogene 1 (KHDC1P1) of which the latter was always expressed in the incompetent and absent in all competent blastocysts. Ontological analysis revealed pathways involved in steroidogenic processes with high confidence. Novel transcripts/exons were also noted. The selection of the blastocyst with the best potential to support full-term pregnancy could reduce the need for multiple treatment cycles and embryo transfers. The main limitation of this study was the low sample size. Despite this shortcoming, the pilot suggests that trophectoderm biopsy could assist with the selection of healthy embryos for embryo transfer. The blastocysts investigated based on the maternal age, identified 182 significantly differentially expressed genes, 91 of which were higher in the young trophectoderm. An important gene ontology that was significantly higher in the trophectoderm cells that derived from young women involved exosome-related transcripts (FDR 2.6E-4). The combination of our analysis together with the literature and murine knockout studies revealed important factors, potentially associated with successful implantation, including clathrin adaptor protein (DAB2), diazepam binding inhibitor acyl-CoA binding protein (DBI) and programmed cell death 2 (PDCD2). The combination of the young trophectoderm and receptive endometrium transcriptome, revealed processes important for implantation, including regulation of apoptosis and MAPK cascade. Surprisingly, trophectoderm expresses 180% more paternal transcripts than expected by chance. Investigating the mammalian paternal contribution to the zygote could improve our understanding of the biology upon fertilisation and potentially provide novel molecular biomarkers for therapeautic purposes. The same methodological pipeline could also be applied in human, with a potential to determine similar or novel paternal biomarkers involved upon egg-to-zygotic transition. As part of the investigation of gene expression during preimplantation embryo development, the current trophectoderm study revealed important molecular biomarkers that could participate in implantation competency, revealing insights on the molecular basis of successful preimplantation embryo development. The approach investigated implantation potential by categorising the samples according to their implantation competency or the maternal age, where young (potentially competent) and advanced (potentially incompetent) maternal blastocysts were studied. The reported biomarkers and molecular pathways indicate the importance of survival signals to the blastocyst and the need for ‘just enough’ apoptosis for successful implantation to occur. Applying these findings could improve fertilisation, blastocyst implantation and overall IVF success rates

Normal hearing function genetics: have you heard all about it? An integrated approach of genome-wide association studies and transcriptome-wide association studies in three Italian cohorts

Introduction: Deepening the genetic mechanisms underlying Normal Hearing Function (NHF) has proven challenging, despite extensive efforts through Genome-Wide Association Studies (GWAS). Methods: NHF was described as a set of nine quantitative traits (i.e., hearing thresholds at 0.25, 0.5, 1, 2, 4, and 8&nbsp;kHz, and three pure-tone averages of thresholds at low, medium, and high frequencies). For each trait, GWAS analyses were performed on the Moli-sani cohort (n = 1,209); then, replication analyses were conducted on Carlantino (CAR, n = 261) and Val Borbera (VBI, n = 425) cohorts. Expression levels of the most significantly associated genes were assessed employing single-nucleus RNA sequencing data (snRNA-seq) on human fetal and adult inner ear tissues. Finally, for all nine NHF traits, Transcriptome-Wide Association Studies (TWAS) were performed, combining GWAS summary statistics and pre-computed gene expression weights in 12 brain tissues. Results: GWAS on the Discovery cohort allowed the detection of 667 SNPs spanning 327 protein coding genes at a p &lt; 10−5, across the nine NHF traits. Two loci with a p &lt; 5 × 10−8 were replicated: 1. rs112501869 within SLC1A6 gene, encoding a brain high-affinity glutamate transporter, reached p = 6.21 × 10−9 in the 0.25&nbsp;kHz trait. 2. rs73519456 within ASTN2 gene, encoding the Astrotactin protein 2, reached genome-wide significance in three NHF traits: 0.5&nbsp;kHz (p = 1.86 × 10−8), PTAL (p = 9.40 × 10−9), and PTAM (p = 3.64 × 10−8). SnRNA-seq data analyses revealed a peculiar expression of the ASTN2 gene in the neuronal and dark cells populations, while for SLC1A6 no significant expression was detected. TWAS analyses detected that the ARF4-AS1 gene (eQTL: rs1584327) was statistically significant (p = 4.49 × 10−6) in the hippocampal tissue for the 0.25&nbsp;kHz trait. Conclusion: This study took advantage of three Italian cohorts, deeply characterized from a genetic and audiological point of view. Bioinformatics and biostatistics analyses allowed the identification of three novel candidate genes, namely, SLC1A6, ASTN2, and ARF4-AS1. Functional studies and replication in larger and independent cohorts will be essential to confirm the biological role of these genes in regulating hearing function; however, these results confirm GWAS and TWAS as powerful methods for novel gene discovery, thus paving the way for a deeper understanding of the entangled genetic landscape underlying the auditory system