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    Biofuncionalização da superfície de membranas fibrosas de policaprolactona para terapias avançadas de tecido esquelético e neural

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    Tese de Doutoramento em Engenharia de Tecidos, Medicina Regenerativa e C√©lulas EstaminaisDamage of the skeletal and neural tissues has a significant impact over the quality-of-life of patients and high socio-economical costs. Current treatment options are not effective in long term, due to the suboptimal integration with the host tissue and limited bioactivity of implantable biomaterials. The immobilization of biomolecules at the surface of biomedical devices has attracted increasing interest, allowing for their local bioavailability avoiding systemic side effects and longer half-life. Envisioning the development of advanced therapies, the electrospun nanofibrous meshes (NFMs) were used as a substrate due to their fibrous structure mimic the extracellular matrix (ECM) of many tissues, allowing cell-cell and cell-biomaterial interactions. For that, the surface of polycaprolactone NFMs was activated and functionalized with amine groups allow for covalent immobilization of defined antibodies, with the capacity to selectively bind autologous biomolecules. Different biofunctional substrates with chondrogenic inductive properties were developed through the surface biofunctionalization of NFM with endogenous human fibronectin, extracellular vesicles or the combination of endogenous Transforming Growth Factor-133 and Insulin-like Growth Factor-I. All these biofunctional substrates successfully induced the chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBM-MSCs) under basal culture conditions. Blood-derived Nerve Growth Factor bound to the surface of NFMs remains bioactive, being an effective inducer of the neurogenic differentiation of a relevant cell line. Additionally, we developed a biofunctional system able to mimic the vasculature of bone tissue, comprising Bone Morphogenetic Protein 2 and Vascular Endothelial Growth Factor in a parallel pattern design. This biofunctional system enabled a spatially defined osteogenic and angiogenic differentiation of hBM-MSCs. The surface biofunctionalization of biomaterial substrates enables developing biofunctional systems envisioning patient-specific devices promoting skeletal and neural tissue regeneration that can maximize and extend the local efficacy and minimize the side effects of the use of biologic based therapies in patients.A deteriora√ß√£o dos tecidos esquel√©tico a neural t√™m um impacto significativo na qualidade de vida dos pacientes e um elevado custo socioecon√≥mico. Os tratamentos atualmente dispon√≠veis n√£o s√£o eficazes a longo termo, devido √† inadequada integra√ß√£o com o tecido hospedeiro e √† baixa bioatividade dos biomateriais implantados. A imobiliza√ß√£o de biomol√©culas constitui uma estrat√©gia alternativa, permitindo a biodisponibilidade local das biomol√©culas evitando efeitos colaterais sist√™micos. Ambicionando desenvolver terapias avan√ßadas, malhas fibrosas produzidas por "electrospinning" (NFMs) foram usadas como substratos polim√©ricos devido √† sua estrutura fibrosa similar a matriz extracelular (ECM) de muitos tecidos, promovendo as intera√ß√Ķes c√©lula-c√©lula e c√©lula-biomaterial. Para isso, NFMs de policaprolactona foram ativadas e funcionalizadas com grupos amina, permitindo a imobiliza√ß√£o covalente de anticorpos pr√©-definidos, com capacidade de ligar seletivamente biomol√©culas aut√≥logas. Foram desenvolvidos diferentes substratos biofuncionais, com propriedades indutoras de diferencia√ß√£o condrog√©nica, mediante liga√ß√£o de fibronectina humana, ves√≠culas extracelulares ou a combina√ß√£o do fator de transforma√ß√£o do crescimento beta 3 com o fator de crescimento semelhante √† insulina tipo I. Todos estes substratos biofuncionalizados foram capazes de induzir a diferencia√ß√£o condrog√©nica de c√©lulas estaminais mesenquimais derivadas de medula √≥ssea humana (hBM-MSCs) sendo cultivadas em condi√ß√Ķes basais. O fator de crescimento nervoso ligado √† superf√≠cie das NFMs permanece bioativo, sendo um indutor eficaz da diferencia√ß√£o neurog√©nica de uma linha celular relevante. Numa outra abordagem, foi desenvolvido um sistema biofuncional capaz de mimetizar a vasculatura de um tecido √≥sseo, ligando paralelamente a prote√≠na morfogen√©tica √≥ssea 2 e o fator de crescimento do endot√©lio vascular sobre uma mesma NFM. Este sistema biofuncional permitiu a diferencia√ß√£o osteog√©nica e angiog√©nica de hBM-MSCs espacialmente definida. Concluindo, a bioftmcionaliza√ß√£o de substratos produzidos por "electrospinning" permite o desenvolvimento de dispositivos biom√©dicos personalizados, capazes de promover a regenera√ß√£o do tecido esquel√©tico e neural, maximizando a efic√°cia local e minimizando os efeitos colaterais do uso de terapias biol√≥gicas em pacientes.To the financial support of the Portuguese Fotmdatron for Science and Technology to maize possible this PhD by awarded me with a PhD scholarship (PD/BD/113797/2015) under the Doctoral Program on Advanced Therapies for Health (FSE/POCK/PD/169/2013). The experimental work was funded by the projects SPARTAN (PTDC/CTM-BIO/4388/2014) and FRONthera (NORTE-01-0145-FEDER-0000232)

    Desenvolvimento de novas estratégias avançadas para a recapitulação da função tímica

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    Tese de doutoramento em Engenharia Biom√©dicaThe thymus is a pivotal lymphoid organ that develops and selects T cells. The absence or pathologies of the thymus results in immunodeficiency, together with increased susceptibility to infections and autoimmune diseases. The gold standard approach to tackle these conditions is thymus transplantation. However, it relies on the use of allogenic tissue, impairing its easy applicability. Furthermore, this organ undergo involution throughout life and also as a result of acute chemical injuries. Nevertheless, it is possible to revert its involution by the administration of enhancers of the thymic function. Thymus tissue engineering has been proposed in response to these needs. Still, an effective solution to this important health problem was not achieved yet. One of the major problems of thymus tissue engineering is the source and functionality of thymic epithelial cells (TECs), which lose their functional signature when cultured in vitro. Different thymic bioengineered strategies for TEC culture and enhancement of the thymic function were herein studied. For that, two thymic extracellular matrix proteins (fibronectin and laminin-2) were immobilized at the surface of electrospun fibrous meshes (eFMs). Their effect on TEC cultures and thymocyte adhesion (in the case of laminin-2) were herein evaluated in vitro. The impact of feeder cell-derived ECM density on TEC cultures was also herein studied. Through these studies, it was demonstrated that the presence of ECM proteins and its density play important roles in the in vitro expansion of TECs. Aiming to mimic the thymus organization, novel silk scaffolds with a bilayered structure were developed and characterized. Using these substrates, it was confirmed that scaffolds microarchitecture and the co-culture of TECs play an important role in TEC functionality. Finally, the effect of intravenously injected conditioned media (CM) obtained from human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells (hAMMSCs) in the thymic function of aged mice was assessed. Experimental data demonstrated that hAMMSCs CM is a valuable resource to enhance the thymic function of aged mice, with a significant increase in T cell production. Ultimately, this thesis enabled the development of novel biomaterial-based substrates facilitating the development of in vitro TEC cultures. It also demonstrated the benefits of a new cell-free therapeutic option for thymic involution that has clinical translational potential.O timo √© um √≥rg√£o linfoide essencial para o desenvolvimento e sele√ß√£o dos linf√≥citos T. A aus√™ncia de timo ou as suas patologias resultam em imunodefici√™ncia, aumentando a suscetibilidade a infe√ß√Ķes e doen√ßas autoimunes. A estrat√©gia terap√™utica mais comum √© a transplanta√ß√£o t√≠mica, embora se baseie no uso de tecido alog√©nico, dificultando a sua aplicabilidade. Por outro lado, este √≥rg√£o involui naturalmente ao longo da vida ou como resultado de les√Ķes qu√≠micas agudas. N√£o obstante, √© poss√≠vel atenuar esta involu√ß√£o mediante administra√ß√£o de potenciadores da fun√ß√£o t√≠mica. A engenharia de tecidos do t√≠mo tem sido proposta como uma estrat√©gia promissora. Uma das maiores dificuldades sentidas na engenharia de tecidos do timo √© a dificuldade no estabelecimento de culturas de c√©lulas epiteliais t√≠micas (TEC), mantendo a sua funcionalidade in vitro. Diferentes estrat√©gias para a cultura de TEC e aumento da fun√ß√£o t√≠mica foram aqui estudadas. Especificamente, duas prote√≠nas da matriz extracelular (MEC) do timo (fibronectina e laminina-2) foram imobilizadas √† superf√≠cie de malhas fibrosas produzidas por ‚Äúelectrospinning‚ÄĚ. O seu efeito sobre culturas de TEC e na ades√£o de tim√≥citos (no caso da laminina-2) foram avaliadas in vitro. O impacto da densidade de MEC derivada de ‚Äúfeeder cells‚ÄĚ foi tamb√©m estudada. Estes estudos demonstraram que a presen√ßa de prote√≠nas da MEC, assim como a sua densidade, desempenham um papel importante no sucesso do estabelecimento de culturas de TECs. Com o objetivo de mimetizar a organiza√ß√£o t√≠mica, novas estruturas bicompartimentalizadas feitas de seda foram desenvolvidas e caracterizadas. Confirmou-se que a microarquitectura porosa destas estruturas e a co-cultura de TEC t√™m um papel importante na sua funcionalidade. Por fim, foi avaliado o efeito da injec√ß√£o sist√©mica de meio condicionado (CM) obtido da cultura de c√©lulas humanas mesenquimais derivadas da membrana amni√≥tica (hAMMSCs) na fun√ß√£o t√≠mica de ratinhos envelhecidos. Os dados experimentais demonstraram que o tratamento com CM √© uma estrat√©gia v√°lida na recupera√ß√£o da fun√ß√£o t√≠mica, mediante o aumento da produ√ß√£o de linf√≥citos T. Em resumo, nesta tese desenvolveram-se novos substratos √† base de biomateriais que permitem a cultura de TECs in vitro. Foi tamb√©m demonstrado que existem benef√≠cios de uma nova estrat√©gia terap√™utica n√£o-celular com CM para a involu√ß√£o t√≠mica, com potencial translacional para a cl√≠nica.Norte2020 ProgramFunda√ß√£o para a Ci√™ncia e a Tecnologia (FCT
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