Efecto de la muramidasa y bacillus subtilis sobre la histomorfometria intestinal, expresión de proteínas de unión estrecha e inmunoglobulinas en pollos de engorde de 21 y 42 días

Abstract

El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la muramidasa y el probiótico Bacillus subtilis, en la salud intestinal en pollos de engorde de 21 y 42 días, evaluando parametros como la histomorfología intestinal, inmunohistoquímica y pruebas de bioquímica sanguínea. Este experimento se llevó a cabo en la Unidad Experimental Avícola de Tekzol S.A.S., ubicada en el municipio de Papayal, Valle del Cauca, Colombia. El estudio se realizó con aves Cobb 500, de un día de edad (50% machos y 50% hembras); distribuidos en 3 tratamientos: CN (Control negativo), con -60 kcal/kg de energía metabolizable y -1%; MUR (Muramidasa) 50 ppm; Bacillus subtilis 200 ppm. A los 21 y 42 días de edad de las aves, estas fueron sacrificadas aleatoriamente (dos aves por réplica), se obtuvieron segmentos de 2 cm de yeyuno e íleon, los cuales se procesaron histológicamente. Los datos obtenidos fueron analizados a través del programa estadístico SAS 9.4. Frente a los valores obtenidos en la histomorfometria se puede indicar que la adición de Bacillus subtilis y muramidasa, estabiliza la microbiota intestinal, promoviendo a el crecimiento del largo de vellosidades y disminución en profundidad de criptas. En cuanto a la expresión de inmunoglobulinas se observó un aumento en la IgY del yeyuno en machos de 21 días del grupo tratado con control negativo. En la inmunohistoquímica se observó diferencia significativa en yeyuno de machos de 21 días tratados con control negativo, donde la ocludina presento expresión fuerte; dando como resultado que el control negativo, puede generar una respuesta adaptativa en el epitelio a estímulos negativos en comparación con otro tratamiento ya sea con probióticos o enzimas digestivas, ya que, en este caso los aditivos pueden robustecer la mucosa y disminuir la inflamación.The objective of this study was to evaluate the effect of muramidase and probiotic Bacillus subtilis on intestinal health in chickens aged 21 and 42 days, evaluating parameters such as gut histomorphology, immunohistochemistry and blood biochemistry tests. This experiment was carried out at the Experimental Poultry Unit of Tekzol S.A.S., located in the municipality of Papayal, Valle del Cauca, Colombia. The study was conducted with one-day-old Cobb 500 birds (50% males and 50% females); distributed in 3 treatments: CN (negative control), with -60 kcal/kg of metabolizable energy and -1%; MUR (muramidase) 50 ppm; Bacillus subtilis 200 ppm. At the birds' 21 and 42 days of age, they were randomly slaughtered (two birds per replica), segments of 2 cm of yeon and ileum, which were histologically processed. The data obtained were analyzed using the SAS 9.4 statistical program. Compared to the values obtained in histomorphometry, it can be indicated that the addition of Bacillus subtilis and muramidase stabilizes the intestinal microbiota, promoting the growth of vellosity length and decrease in depth of crypts. As for the expression of immunoglobulins, an increase in the IgY of the jejunum was observed in 21-day males of the group treated with a negative control. In immunohistochemistry, a significant difference was observed in jejunum of 21-day males treated with negative control, where ocludine presented strong expression; resulting in the negative control, can generate an adaptive response in the epithelium to negative stimuli compared to other treatment with either probiotics or digestive enzymes, since in this case the additives can strengthen the mucosa and decrease inflammation.CONTENIDO Pag. RESUMEN . VI CONTENIDO . VII I LISTA DE FIGURAS . VI LISTA DE TABLAS . VI LISTA DE SÍMBOLOS Y/O GLOSARIO . 7 1. OBJETIVOS . 12 1.1. OBJETIVO GENERAL . 12 1.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS . 12 2. MATERIALES Y MÉTODOS . 13 2.1. Ubicación experimental y consideraciones éticas 13 2.2. Animales, instalaciones y manejo . 13 2.3. Programa de alimentación . 14 2.4. Tratamientos experimentales . 14 2.5. Sacrificio de animales y obtención de muestras 15 2.6. Procesamiento histológico . 15 2.7. Obtención y análisis de resultados . 15 Histomorfométria . 15 Inmunohistoquímica . 16 Inmunoglobulinas . 17 2.8. Análisis estadístico . 17 3. RESULTADOS . 18 3.1. Histomorfométria . 18 3.1.1. Hembras de 21 días de edad . 18 3.1.2. Hembras de 42 días de edad . 19 3.1.3. Machos de 21 días de edad . 21 XI Contenido VIII 3.1.4. Machos de 42 días de edad . 22 3.2. Inmunoglobulinas . 24 3.3. Inmunohistoquímica . 26 3.3.1. Hembras . 26 3.3.2. Machos . 33 4. DISCUSIÓN . 49 5. CONCLUSIONES . 49 6. RECOMENDACIONES . 49 7. BIBLIOGRAFÍA . 51 IX Contenido LISTA DE FIGURAS Figura 1. Representación de colorimetría en base a reacción inmunohistoquímica en cuanto a proteinas de union estrecha . 26 Figura 2. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Yeyuno; hembras; 21 días de edad . 27 Figura 3. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Íleon; hembras; 21 días de edad . 28 Figura 4. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Yeyuno; hembras; 42 días de edad . 29 Figura 5. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Íleon; hembras; 42 días de edad . 30 Figura 6. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Yeyuno; machos; 21 días de edad . 34 Figura 7. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Íleon; Machos; 21 días de edad . 35 Figura 8. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Yeyuno; machos; 42 días de edad . 36 Figura 9. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Íleon; machos; 42 días de edad . 37 X Contenido LISTA DE TABLAS Tabla 1. composición de las dietas experimentales 14 Tabla 2. Tabla de referencias para categorización de coloración en inmunohistoquímica según Cizkova et al., (2021) . 16 Tabla 3. Media y desviación estándar (±) con relación a el tamaño histomorfométrico de vellosidades y criptas (largo y ancho) de yeyuno e íleon, con los tratamientos en hembras de 21 y 42 días de edad . 20 Tabla 4. Media y desviación estándar (±) con relación a el tamaño histomorfométrico de vellosidades y criptas (largo y ancho) de yeyuno e íleon, con los tratamientos en machos de 21 y 42 días de edad . 23 Tabla 5. Media y desviación estándar (±) en relación con la expresión de inmunoglobulinas de los tratamientos en hembras de 21 y 42 días de edad 25 Tabla 6. Media y desviación estándar (±) en relación con la expresión de inmunoglobulinas de los tratamientos en machos de 21 y 42 días de edad 25 Tabla 7. Media y desviación estándar (±) con relación a la expresión de proteínas estrechas de yeyuno e íleon, con los tratamientos en hembras de 21 y 42 días de edad 31 Tabla 8. Categorización de la expresión de proteínas estrechas de yeyuno e íleon, con los tratamientos en hembras de 21 y 42 días de edad . 32 Tabla 9. Media y desviación estándar (±) con relación a la expresión de proteínas estrechas de yeyuno e íleon en machos de 21 y 42 días . 49 Tabla 10. Categorización de la expresión de proteínas estrechas de yeyuno e íleon, con los tratamientos de machos de 21 y 42 días . 49 Introducción 7 LISTA DE SÍMBOLOS Y/O GLOSARIO Símbolo Significado AC Ancho de Cripta AV Ancho de vellosidad CN control negativo DAB cromógeno 3,3' - Diaminobenzidine HRP enzima peroxidasa de rábano picante IGA Inmunoglobulina A IGM Inmunoglobulina M IGY Inmunoglobulina Y IHQ Inmunohistoquímica IH Íleon hembra IM Íleon macho LC Largo de Cripta LV Largo de vellosidad MUR Muramidasa RAM La resistencia antimicrobiana TGI Tracto gastrointestinal TJ uniones estrechas YH yeyuno hembra YM yeyuno macho ZO Zona de oclusión Introducción 8 I NTRODUCCIÓN La población microbiana del tracto gastrointestinal (TGI) es un recurso natural que se puede desarrollar y utilizar para reducir el impacto de las bacterias patógenas que afectan la salud animal, el desempeño y la seguridad alimenticia (Callaway et al., 2008). La microbiota intestinal posee un enorme potencial metabólico y genera variaciones en la salud intestinal del huésped (Rinttilä & Apajalahti, 2013). El equilibrio de la población intestinal se hace relevante, ya que, hay gran variedad de especies de bacterias, que pueden afectar o beneficiar al organismo, dependiendo la cantidad y susceptibilidad del huésped, lo cual es un vínculo entre la microbiota y la salud intestinal de las aves (Larsen et al., 2021). El sistema gastrointestinal también posee una gran importancia al ser regulador y protector frente a la entrada de diferentes sustancias al organismo, el epitelio intestinal posee mecanismos y unidades especializadas como los enterocitos, las células caliciformes y las células de Paneth, que se hacen necesarias en el combate contra microrganismos patógenos. El intestino, estructuralmente posee diferentes componentes como lo es el borde intestinal, este es relevante por dos estructuras específicas, que son las vellosidades y criptas (Gassler, 2017). Las vellosidades brindan un área elongada para la absorción de nutrientes (Uni et al, 1998) y las criptas intestinales poseen células especializadas, las cuales participan en la defensa antimicrobiana y en la regulación del nicho de células madre, favoreciendo la proliferación y regeneración de células epiteliales, incluidas las células absorbentes y secretoras (Gassler, 2017). Para que el intestino tenga la capacidad de cumplir las funciones, estas estructuras continuamente se reemplazan desencadenando así regeneración y constante recambio celular (Sancho et al., 2003). También se ha mencionado que la funcionalidad de la barrera intestinal depende de la interacción de las células, por ejemplo, los enterocitos poseen la capacidad de regular la entrada de sustancias a través de sus componentes intracelulares (vía transcelular) o a través Introducción 9 de uniones estrechas (vía paracelular) (Fasulo, 2014), estas uniones estrechas (TJ) son bandas angostas que rodean la zona superior, apical o el espacio lateral de las células epiteliales que generan puntos de fusión (Gasbarrini & Montalto, 1999: Roussel, et al., 2015), están formadas por proteínas específicas, generando áreas altamente dinámicas y permeables, regulando el movimiento transepitelial pasivo de las moléculas que puede ser modificado en respuesta a estímulos tanto externos como intracelulares (Liang & Weber, 2014), con el fin de generar una cerradura hermética frente a diferentes agentes, desempeñando una labor en la vía paracelular, al favorecer el transporte unidireccional a través de los epitelios, al mitigar el movimiento de las proteínas entre las membranas apical y basolateral, generando así equilibrio y manteniendo adecuadamente delimitado el medio externo del interno (Arenas - Bazán, 2017). Un desbalance en los factores anteriormente nombrados puede producir enfermedades intestinales y pérdidas económicas para el productor, derivadas de la patogenicidad y mortalidad (Revidatti et al., 2001; Olaya et al., 2010; Angulo et al., 2004 ; Larsen et al., 2021), ya que, en condiciones normales, la microbiota intestinal y el epitelio regulan los microorganismos patógenos, disminuyendo la acción de células del sistema inmunológico; si hay inmunosupresión o desequilibrio de la microbiota en el intestino, las células inmunitarias pueden inducir daño a las células epiteliales (Barbara et al., 2021), provIncluye bibliografíaPregradoMédico(a) Veterinario Zootecnist