Genomische Progression von disseminierten Tumorzellen aus dem Knochenmark von Brustkrebspatientinnen vor und nach Manifestation von Metastasen

Abstract

Hintergrund: Die Absiedelung von disseminierten Tumorzellen (DCCs) in das Knochenmark bei Brustkrebspatienten stellt einen frühen Schritt dar, der bereits während der Tumorigenese beginnt und spielt eine entscheidende Rolle im Krankheitsverlauf von Brustkrebserkrankungen. Die Zellen sind in der Lage (neo-)adjuvante Chemotherapien zu überdauern und sich zu Metastasen weiterzuentwickeln (Minimale Resterkrankung). Sie haben Einfluss auf die Prognose, das krankheitsfreie und allgemeine Überleben der Patienten. Allerdings existieren keine adäquaten Möglichkeiten, den weiteren Krankheitsprogress, besonders die molekulare Evolution der DCC während der minimalen Resterkrankung zur verfolgen oder in dieser Krankheitsphase vor dem Auftreten von Metastasen zielgerichtet zu therapieren. In dieser Arbeit wird versucht einen Einblick zu geben, wie sich die DCCs im Krankheitsverlauf weiterentwickeln. Hierzu wurden DCCs von mehreren Zeitpunkten nach Diagnosestellung und adjuvanter Chemotherapie aus dem Knochenmark isoliert und sequenziert. Methoden: Zur Verfügung stehende tiefgefrorene mononukleäre Zellen aus dem Knochenmark von Brustkrebspatientinnen (n = 56) wurden in dieser Arbeit auf Cytokeratin gefärbt und durch Lasermikrodissektion und Mikromanipulator als Einzelzelle (n = 281) isoliert. Anschließend wurden die Copy Number Variations (CNV) mittels LowPass Sequenzierung untersucht und die Entwicklung der Zellen im Verlauf herausgearbeitet und Vergleiche mit den Subgruppen angestellt. Als Kontrollzellen dienen CD68-positive Zellen, die nach gleichem Protokoll gefärbt und isoliert wurden. Fünf Patientinnen (M0 und M1), die sich aufgrund vieler DCCs mit guter Qualität von unterschiedlichen Zeitpunkten der KM-Punktion besonders gut zu einer vergleichenden Analyse eigneten, wurden ausgewählt und die DCCs sequenziert und analysiert. Ergebnisse: Es konnte eine erfolgreiche Methode zur Gewinnung von Tumor- und Kontrollzellen entwickelt werden. Diese ermöglichte auch, Kontrollzellen von Objektträgern zu gewinnen, von welchen bereits DCCs isoliert wurden. Zudem konnte gezeigt werden, dass der Einfluss des Lasers im Rahmen der Mikrodissektion auf die DNA durch eine vorherige Anfärbung der Zellen ausreichend reduziert werden kann, sodass signifikante Unterschiede zwischen CK+ DCCs und CD68+ Kontrollzellen aufgezeigt werden konnten. DCCs konnten sowohl aus dem Knochenmark von rezidivfreien als auch von metastasierten Patienten isoliert werden. In beiden Fällen präsentierten sich die Tumorzellen sehr heterogen. Es bestand kein Unterschied in den CNVs rezidivierter und nicht-rezidivierter Patientinnen. Es zeigte sich eine statistische nicht signifikante Tendenz, dass M0-Patienten im Vergleich zu M1-Patienten mehr Genverluste tragen. Diskussion: Diese einzigartige Kohorte ermöglicht einen Einblick in die Entwicklung der DCCs nach Beendigung der adjuvanten Chemotherapie und damit in die Latenzphase bei Brustkrebspatientinnen. Da im Moment noch keine Möglichkeiten der Therapie der minimalen Resterkrankung bestehen, wird erst wieder mit dem Auftreten von Metastasen mit einer erneuten Therapie begonnen. Die gesehene Heterogenität der Zellen ist möglicherweise Ausdruck der genomischen Instabilität und kann einen Ansatz zur Therapie bieten. Eine weiterführende Analyse von Tumor- und Metastasengewebe könnte Rückschlüsse darauf ermöglichen, wann es zu einer Abspaltung der DCCs gekommen ist und welche Eigenschaften der DCCs für eine Progression verantwortlich sind, da offensichtlich nicht alle der Tumorzellen zu einer Proliferation in der Lage sind. Um molekulare Subgruppen der DCCs zu definieren waren allerdings die Fallzahlen dieser Kohorte zu gering