Exploring the particulate nature of HIV-based virus-like particles: a path to efficient and cost-effective purification

Abstract

Die Notwendigkeit einer raschen Entwicklung von Impfstoffen wurde während der Pandemie des Coronavirus deutlich. Neben diesem neuartigen Virus ist die Entwicklung wirksamer Impfstoffe gegen andere tödliche Viren wie z.B. das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) nach wie vor eine Herausforderung. Seit den 1980er Jahren ist dieses Virus für viele Todesfälle verantwortlich, und ein Impfstoff befindet sich aufgrund seiner komplexen Natur und der vielen verschiedenen Mutationen noch in der Entwicklung. Ein vielversprechender Weg zu einem Impfstoff könnten so genannte Mosaic HIV-Antigene sein. Auf dieser Grundlage entwickelte die Forschungsgruppe von Jörn Stitz ein neuartigen virusähnlichen Partikel (VLP). Neben der Entwicklung eines Impfstoffs selbst spielt auch der Aufreinigungsprozess (DSP) eine wichtige Rolle bei der Implementierung eines erfolgreichen Impfstoffs. Derzeit basiert die typische Prozessentwicklung auf der Grundlage von heuristischen Methoden und der statistischer Versuchsplanung. Es gibt nur wenige Veröffentlichungen, die darauf abzielen, einen tieferen Einblick in die grundlegenden Mechanismen der verschiedenen Prozessschritte zu geben. Mit dieser Arbeit soll diese Wissenslücke überwunden werden, was zu einer Verbesserung des DSP solch komplexer Partikel führt. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt daher auf der Untersuchung der physikalisch-chemischen Eigenschaften der VLP in verschiedenen Entwicklungsstadien. Die Limitierung der Konzentrierung mittels Ultrafiltration (UF) in tangentialer Strömung und der Einfluss der Scherspannung auf die VLP. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde das elektrokinetische Verhalten von HIV basierten VLPs mittels dynamischer Lichtstreuung untersucht. Wir haben zwischen zwei Typen von VLPs unterschieden, um deren Einfluss auf das Oberflächenpotential zu untersuchen. Mit den gewonnenen Daten konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Typen festgestellt werden und das Modell von Ohshima wurde implementiert, um ihr Verhalten als negativ geladene, weiche Partikel aus der Perspektive der Kolloidchemie zu beschreiben. Dieses Modell konnte das elektrokinetische Verhalten bei hohen Ionenstärken (60 mmol L−1) gut vorhersagen, versagte aber in niedriger Ionenstärkebereichen. Dies deutet auf ein komplexeres Verhalten hin, und das Modell der weichen, mehrschichtigen Partikel wurde als eine vielversprechende Verbesserung für die HIV basierten VLPs eingeführt. Außerdem wurde der isoelektrische Punkt der beiden VLPs bei einem pH-Wert von etwa 3.8 bestimmt. Darüber hinaus wurde eine systematische Untersuchung der Tangentialflussfiltration (TFF) und ein hydrodynamischer Ansatz entwickelt, um das Optimierungspotenzial und die begrenzenden Prozessparameter aufzuzeigen. Diese Untersuchung zeigte, dass die UF-TFF durch hydrodynamische Effekte gesteuert wird und die Geschwindigkeit sich signifikant auf die Prozessleistung auswirkt. Bei der UF-TFF muss die Integrität der VLPs sichergestellt werden, welche durch hohe Scherraten beeinflusst werden kann. Daher wurde die chemische und mechaniche Stabilität der VLPs untersucht. Die chemische Stabilität zeigt wie erwartet eine Zerstörung der VLPs durch Tensiden. Im Gegensatz dazu deutet die Scherstabilität darauf hin, dass eine Scherung nach Lagerung zur Aggregation führt. Die Scherstabilität kann durch einen Mediumwechsel zu niedrigeren Ionenstärken erhöht werden und die Antigene auf der Oberfläche scheinen ebenfalls die Stabilität zu erhöhen.The need for rapid vaccine development gained significant attention during the corona virus (SARS-CoV-2) pandemic. Besides this novel virus, the need for efficient vaccines against other deadly viruses like the human immunodeficiency virus (HIV) is still a challenging task. Since the 1980s, this virus caused many deaths and a vaccine is still under development due to his complex nature and many different mutations. A promising path could be a so called mosaic (Mos) HIV antigens based vaccine. On this basis, the research group of Jörn Stitz develop a new virus-like particle (VLP). Besides the development of a vaccine itself, the downstream process (DSP) has a major role for the implementation of a successful vaccine. Currently, the typical process development is based on trail and error and design of experiment for the optimization purposes. There are only a small amount of publication, which aim to provide a deeper insight into the fundamental mechanisms involved in the different process steps. With this work, the knowledge gap should be overcome leading to an improvement of the DSP of such complex particles. Therefore, the focus in this work is on the investigation of the physico-chemical properties of the VLP in comparison of different development stages of the HIV-based VLPs. The limits for the concentration during ultrafiltration (UF) in tangential flow and the influence of the shear stress on this VLP. To fulfill this aim, the electrokinetical behavior of HIV-based VLPs was investigated by means of dynamic light scattering (DLS). We differentiate between two types of VLPs to investigate the influence on the surface potential. With the gained data, no significant differences between both types were established and we implemented the model of Ohshima to describe their behavior as negatively charged soft particle from the perspective of colloid chemical. This model could predict the electrokinetic behavior at high ionic strength (60 mmol L−1) very well, but failed at low ionic strength region. This suggests a more complex behavior and the soft mulitlayer particle model was introduced as a promising upgrade for the HIV-based VLPs. Additionally, the isoeletrical point (IEP) of both VLPs was at a pH value of about 3.8. Furthermore, a systematic investigation of the tangential flow filtration (TFF) was carried out and a hydrodynamic approach was developed to show the optimization potential and the limiting process parameters. This investigation showed that the UF-TFF is controlled by hydrodynamic effects and the impact of the velocity had a significant influence on the process performance. During the optimization of this process step, the integrity of the particle had to be ensured, which could be influenced by high flow velocity or shear rate, respectively. Finally, the stability of these VLPs was examined with regard to chemical and mechanical effects. The chemical stability show no unexpected results and the VLPs are disrupted under the influence of surfactants. In contrast, the mechanical stability against shear forces indicates a shear induces aggregation after storage. The stability can be increased by changing the suspension media to lower ionic strength and higher surface potential, respectively. Additionally, the presence of envelope antigens seems to increase the stability, too