Implementing and advancing Cell Painting-based phenotypic profiling for hazard assessment of substances with endocrine activity

Abstract

Phenotypic changes in cell morphology and organization can indicate perturbations in cell functions, potentially leading to adverse health effects such as organ dysfunction or cancer. Thus, image-based high-throughput screening (HTS) and high-throughput phenotypic profiling (HTPP) approaches play an important role in basic research, drug discovery, and chemical hazard assessment. The disruption of physiological estrogen function by environmental chemicals is an example of factors contributing to cell function alterations and potentially breast cancer progression. Thus, identification of substances that interfere with hormone pathways and elicit adverse health effects, so-called endocrine disrupting chemicals (EDC), is of high relevance. Additionally, the phasing out of animal-based regulatory testing methods in the EU and beyond necessitates robust in vitro HTS and HTPP approaches utilizing cell-specific, functional readouts for hazard assessment of environmental chemicals, such as EDCs and compounds with specific target organ toxicity (STOT). Cell Painting (CP) is a powerful image-based HTPP method compatible with artificial intelligence (AI)-driven image and data analysis as well as capable of reflecting mode-of-action (MoA)-driven cellular responses caused by compound treatments, genetic perturbations, or disease states in an untargeted manner. However, the CP assay still holds methodical limitations regarding multiplexing capacity, physiological relevance of cell culture conditions, and diversity of cell types, which limits its use for hazard assessments. In this PhD project, the CP assay was implemented in steroid hormone-responsive MCF-7/vBOS cells for identification of environmental chemicals with diverse MoAs, including endocrine activity. Moreover, the CP assay was further developed into the novel Cell Painting PLUS (CPP) assay, which is an efficient, robust, and broadly applicable HTPP approach that overcomes certain methodological limitations of the CP method. A small-scale screen of 15 reference compounds demonstrated that the iterative staining-elution cycle of CPP significantly expands the multiplexing capacity of the CP method. Importantly, it also improves the specificity of phenotypic profiles through completely separate imaging and analysis of single dyes in individual channels. Qualitative and quantitative analysis of screening data confirmed the ability of CPP-based HTPP in MCF-7/vBOS cells to reflect diverse MoA-driven phenotypes, including estrogen receptor (Er) pathway inhibition. In this context, this PhD project also established state-of-the-art requirements for screening large-compound libraries using two targeted HTS approaches, E-Morph assay and E-Morph screening assay, to generate reference data for identifying Erspecific phenotypes in HTPP. To improve the robustness and physiological relevance of image-based HTS and HTPP, serum-free cell culture conditions for MCF-7/vBOS cells were systematically explored. Overall, this PhD project set the ground for future CPP-based large-scale screenings identifying endocrine- or STOT-related compounds and enhancing the exploration of HTPP in the context of hazard assessment. Together with existing data from targeted phenotypic HTS, HTPP data was envisioned to enable an iterative hit prediction and testing cycle supported by AI-based analysis tools.Phänotypische Veränderungen in Zellmorphologie und -aufbau können auf funktionelle Störungen hinweisen, die potenziell mit der Entstehung gesundheitsschädlicher Effekte wie Organdysfunktionen oder Krebs zusammenhängen. Bildbasierte Hochdurchsatzverfahren für Screenings (HTS) und „Phenotypic profiling“ (HTPP) spielen daher eine wichtige Rolle in der Grundlagenforschung, Wirkstoffentwicklung sowie Gefahrenbeurteilung von Chemikalien. Die Störung der physiologischen Östrogenfunktion durch Umweltchemikalien ist ein Beispiel für Faktoren, die zu Veränderungen der Zellfunktionen und potenziell zur Entstehung von Brustkrebs beitragen. Die Identifikation von Substanzen, die Hormonsignalwege stören und gesundheitsschädliche Effekte hervorrufen, sogenannte endokrine Disruptoren (EDC), ist daher hoch relevant. Zudem erfordert die in und außerhalb der EU geplante Abschaffung tierbasierter regulatorischer Testmethoden robuste, auf zellspezifische und funktionale Parameter basierende in vitro HTS- und HTPP-Methoden zur Gefahrenbeurteilung von Umweltchemikalien, wie EDCs und Substanzen mit spezifischer Zielorgan-Toxizität (STOT). Cell Painting (CP) ist eine leistungsstarke, bildbasierte HTPP-Methode, die mit auf künstlicher Intelligenz (AI)-basierten Analysetools kombinierbar ist. Der „untargeted“ CP Assay kann zelluläre, Wirkmechanismus (MoA)-abhängige Reaktionen auf Wirkstoffbehandlungen, genetische Störungen oder Krankheiten abbilden. CP weist jedoch methodische Limitationen bzgl. der Multiplexing-Kapazität, physiologischen Relevanz der Zellkulturbedingungen und Diversität der Zelltypen auf, was seine Nutzung in der Gefahrenbeurteilung einschränkt. In dieser Arbeit wurde der CP Assay in steroid-hormon-responsive MCF-7/vBOS Zellen implementiert, um Umweltchemikalien mit diversen MoAs, einschließlich endokriner Aktivität, zu identifizieren. Zudem wurde der CP Assay zum innovativen Cell Painting PLUS (CPP) Assay weiterentwickelt, einem effizienten, robusten und breit anwendbaren HTPP-Ansatz, der bestimmte methodische Einschränkungen von CP überwindet. Das Screenen von 15 Referenzsubstanzen zeigte, dass der iterative Färbe-Elution-Zyklus von CPP die Multiplexing-Kapazität der CP-Methode erheblich erweitert. Dadurch konnte insbesondere die Spezifität der phänotypischen Profile verbessert werden, da eine vollständig getrennte Bilderfassung und -analyse einzelner Farbstoffe in individuellen Kanälen ermöglicht wird. Qualitative und quantitative Analysen bestätigten, dass CPP-basiertes HTPP in MCF-7/vBOS Zellen diverse MoAabhängige Phänotypen widerspiegeln kann, inklusive eines inhibierten Östrogenrezeptor (Er)-Signalwegs. In diesem Kontext wurde unter Verwendung zweier „targeted“ HTS-Ansätze, dem E-Morph Assay und dem E-Morph Screening Assay, modernste Anforderungen für das Screenen großer Wirkstoffbibliotheken etabliert, um Referenzdaten zur Identifizierung Er-spezifischer Phänotypen in HTPP zu generieren. Um die Robustheit und physiologische Relevanz von bildbasierten HTS und HTPP zu verbessern, wurden zudem serumfreie Zellkulturbedingungen für MCF-7/vBOS Zellen systematisch untersucht. Diese Arbeit legt damit den Grundstein für große CPP-basierte Screenings zur Identifikation von endokrinen oder STOT-relevanten Substanzen sowie der Weitererforschung von HTPP zur Gefahrenbeurteilung. Zusammen mit bestehenden Daten von „targeted“ phänotypischen HTS und AI-basierten Analysetools sollen HTPP-Daten einen iterativen Zyklus aus Aktivitätsprädiktion und -testung ermöglichen