Aspetti morfologici, ultrastrutturali e molecolari dell’interazione tra lipofagia, lipasi acida lisosomiale e colestasi nell’epatopatia steatosica non alcolica (NAFLD)

Abstract

Introduzione La malattia epatica steatosica non alcolica (NAFLD) è caratterizzata da un eccessivo accumulo di lipidi all'interno degli epatociti che conduce ad infiammazione epatica e fibrosi. La disfunzione dell’autofagia ovvero del processo mediante il quale la cellula elimina i cataboliti attraverso i lisosomi, è uno dei meccanismi fisiopatologici che portano all’accumulo di lipidi nella NAFLD. La lipofagia è il meccanismo autofagico attraverso il quale la cellula elimina le gocciole lipidiche costituite da esteri del colesterolo e trigliceridi attraverso il catabolismo lisosomiale. Nel lisosoma la lipasi acida lisosomiale è l’enzima preposto al catabolismo degli esteri del colesterolo. Un altro percorso di eliminazione di colesterolo e fosfolipidi per l’epatocita è costituito dalla loro secrezione nella bile. Dati emergenti suggeriscono che la colestasi in pazienti NAFLD rappresenti un fattore predittivo di prognosi sfavorevole, indicando un ruolo potenziale dell'alterata secrezione biliare nella patogenesi e nella progressione della malattia. Recenti studi hanno evidenziato che la lipofagia può essere disregolata dagli acidi biliari che esercitano un effetto inibitorio (CholeSTOPhagy) in corso di patologie colestatiche. Obiettivo dello studio: In una coorte di pazienti NAFLD abbiamo voluto valutare se fosse presente un impairment lipofagico e se questo fosse correlato a segni di colestasi e/o di disfunzione lisosomiale. Metodi: Abbiamo innanzitutto valutato il contenuto e l'attività della LAL in modelli sperimentali in vitro e in vivo di NAFLD. In totale, sono stati inclusi nello studio 87 pazienti sottoposti a biopsia epatica. Tramite metodiche di immunoistochimica si sono valutate l’espressione di LAL, LAMP1 (marcatore lisosomiale), p62/SQSTM1 (marcatore di impairment autofagico), CK7 (per la valutazione della componente colestatica: cellule epatiche progenitrici HPC ed epatociti intermedi IH), CD-10 (per la valutazione dei canalicoli biliari). E’ stata eseguita un’analisi al micrscopio elettronico a trasmissione per la valutazione delle componenti autofagiche e i segni epatocellulari di colestasi. In un sottogruppo di 38 pazienti tramite la metodica di Nanostring nCounter si è analizzata l’espressione genica di 20 geni coinvolti implicati nel processo autofagico (compresa l’espressione di LAL) e nella secrezione biliare di colesterolo. Risultati Abbiamo evidenziato una riduzione dell’attività di LAL nel modello cellulare 6 di NAFLD. La diminuzione dell'attività di LAL è mediata dall'ubiquitinazione e la proteina ubiquitinata presenta una localizzazione extralisosomiale. In vivo il contenuto epatico di LAL totale è più elevata nei fegati dei pazienti con punteggio NAS 3-5 e 6-7 rispetto a quelli con punteggio NAS 0-2. L'espressione del gene di LAL è risultata lievemente aumentata nei pazienti con NAFLD rispetto ai controlli sani. Dallo studio è emerso un blocco della machinery autofagica con un aumento dell’espressione di p62/ SQSTM1 che correla significativamente con fibrosi e NAS (p=0.01 R=0.322; p=0.01 R=0.157). Nei pazienti con NAFLD sono stati evidenziati lisosomi con lume visibile e sono stati identificati alla TEM come lipolisosomi. L’ accumulo anomalo di LAL ubiquitinata correla con il NAS e con il numero di lipolisosomi (p=0.04, R=0.128). La compromissione dell'autofagia è stata associata ad alterazioni legate alla colestasi nel compartimento biliare: è stato osservato un aumento della reazione duttulare e l'espansione di epatociti intermedi. Si è infatti osservato un aumento parallelo del marcatore di compromissione dell'autofagia p62/SQSTM1 e delle cellule progenitrici epatiche (HPCs) e delle degli epatociti intermedi (IH)(R=0.392, p=0.016; R=0.370, p=0.026) All’analisi ultrastrutturale con il microscopio elettronico a trasmissione si sono evidenziate significative differenze a livello dei canalicoli biliari tra pazienti con NAFLD lieve e severa. Inoltre abbiamo osservato una riduzione dell’espressione di ABCG5/8 con l’aumentare del balooning nei pazienti con colestasi. Conclusioni Nei pazienti NAFLD si assiste ad un impairment della lipofagia con aumento di lisosomi repleti di lipidi non catabolizzati chiamati lipolisosomi. La riduzione dell’attività di LAL sembra possa contribuire alla disfunzione lisosomiale. Inoltre una colestasi a livello istologico ma non sierologico correla con la disfunzione autofagica e con un fenotipo di malattia più severo