Molekulare und zelluläre Mechanismen genetischer Risikovarianten für Diabetes bei GRB14/COBLL1

Abstract

Type 2 diabetes (T2D) is a common complex metabolic disease, caused by the interplay of environmental and genetic risk factors. Diet and lifestyle are long acknowledged as the most important environmental risk factors. Twin studies support a strong genetic component, with an estimated narrow-sense heritability of 54–83%. Additional evidence for the heritability of T2D originates from genome-wide association studies (GWAS). These studies report associations between genomic haplotypes and a disease. Until today, GWAS have revealed more than 186 genetic risk loci for T2D. The majority of these loci are located in the non-coding part of the genome, which challenges the dissection of the signals and the type of action leading to T2D. One complex and challenging-to-interpret T2D risk locus is COBLL1/GRB14. Several intronic variants near the 3’-UTR (2q24.3) of the cordon bleu like protein 1 (COBLL1) and intergenic between the growth factor receptor-bound protein 14 (GRB14) and COBLL1, were associated with insulin resistance and an increased risk for T2D. Although, GRB14 – the negative regulator of the insulin receptor – was proposed to be causal for the T2D risk association at this locus, the mechanisms underlying this pathomechanism are not yet understood. Here, we aim to dissect the role of non-coding variants at the T2D risk locus COBLL1/GRB14. We establish (1) the relevant cell type of action, (2) the causal variant, (3) the upstream regulator and (4) the downstream target leading to the organismal phenotype. We exploit epigenomics and regulatory genomics data sets, coupled with a systematic experimental validation of regulatory and cellular phenotypes. We show that the non-coding rs6712203 C-to-T single-nucleotide polymorphism may underlie in parts the T2D association of the GRB14/COBLL1 locus association, by a disrupted POU class 2 homeobox 2 (POU2F2) activator motif in risk C-allele carriers. Epigenetic maps reveal a cell type-specific enhancer, surrounding rs6712203 in adipose- and mesenchymal-derived cells. Cis- and trans- conditional analysis in CRISPR/Cas9 edited primary human adipocytes reveal its functional core: Conditional on POU2F2, the rs6712203-T non-risk variant enhancer activation increases the expression of the COBLL1 gene in adipocytes, whereas the expression of the GRB14 gene appears to be unchanged. Further, we find that a perturbed COBLL1 gene expression leads to disturbed actin remodeling during adipogenesis followed by a lower insulin-stimulated glucose uptake, triglyceride storage and response to lipolytic stimulation. Our results explore the mechanistic basis for the COBLL1/GRB14 association with T2D. We show a connection between the expression of the COBLL1 gene in adipose tissue and the non-coding T2D signal at 2q24.3, by uncovering the regulatory variant rs6712203 and its transcriptional regulator POU2F2. For COBLL1, we reveal a previously unknown role in adipocyte actin remodeling, which provides a link to adipocyte maturation, lipid storage and release - contributors to insulin resistance and T2D.Typ 2 Diabetes (T2D) ist eine Stoffwechselkrankheit mit einer weltweit hohen und stetig steigenden Prävalenz, die durch das Zusammenspiel von Umwelt und Genetik hervorgerufen wird. Ernährung und Lebensweise sind seit langem als Einflussfaktoren für T2D bekannt, die genetische Grundlage von T2D - mit einer Vererbungsrate von 54-83 % - wurde hingegen erst vor einigen Jahren in Zwillingsstudien beschrieben. Genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) lieferten weitere Evidenz für den Einfluss der Genetik auf eine Erkrankung mit T2D. GWAS, welche den Zusammenhang zwischen genomischen Haplotypen und einer Krankheit untersuchen, haben mehr als 186 Varianten identifiziert, welche das Risiko für T2D erhöhen. GWAS wurden in der Vergangenheit kritisiert, da die meisten der identifizierten Risikovarianten im nicht kodierenden Teil des Genoms und in komplexen Haplotypen lokalisiert sind, wodurch die Interpretation der zugrundeliegenden biologischen Mechanismen nicht direkt möglich ist. Eine besonders schwer zu interpretierende T2D-Assoziation liegt am GRB14/COBLL1 Lokus vor. Hier wurden nicht kodierende Varianten, die in der Nähe der 3'- nicht kodierenden Region (3'- UTR) (2q24.3) des Cordon bleu like protein 1 (COBLL1) Gens und zwischen den Genen growth factor receptor-bound protein 14 (GRB14) und COBLL1 liegen, mit Insulinresistenz und T2D assoziiert. Obwohl GRB14, welches als negativer Regulator des Insulinrezeptors bekannt ist, als kausaler Kandidat für das Risikosignal vorgeschlagen wurde, sind die zugrundeliegenden Mechanismen für das erhöhte T2D-Risiko bisher noch nicht bekannt. In dieser Arbeit sollen die Rolle der nicht kodierenden Varianten innerhalb des T2D-Risikolokus GRB14/COBLL1 untersucht werden: Es sollen (1) der verantwortliche Zelltyp, (2) die kausale Variante (3) der Masterregulator und (4) das regulierte Gen, welche zum erhöhten Risiko für T2D führen, identifiziert werden. Hierzu nutzen wir epigenomische und genetische Techniken und Datensätze, in Verbindung mit einer systematisch experimentellen Validierung von regulatorischen und zellulären Phänotypen. Unsere Daten zeigen, dass der nicht kodierende rs6712203 C → T Polymorphismus, durch ein konserviertes POU2F2 Aktivator-Motiv in T-Nicht-Risiko Allel-Trägern, dem GWAS T2D Risiko-Signal im GRB14/COBLL1 Lokus, zum Teil zugrunde liegen könnte. Epigenetische Analysen in Adipozyten und mesenchymalen Zellen zeigen einen Zelltyp spezifischen Enhancer am rs6712203-Lokus. Cis- und trans- abhängige Experimente in CRISPR/Cas9 editierten primären humanen Adipozyten zeigen die Funktionsweise: Abhängig von POU2F2 wird die Expression des Gens COBLL1 in Adipozyten von rs6712203-T Nicht-Risiko Allel-Trägern erhöht, wobei keine Regulation von COBLL1 in rs6712203-C Risiko Allel-Trägern stattfindet. Die Expression von GRB14 wird durch die rs6712203 Editierung nicht beeinflusst. Die Funktion von COBLL1 in Adipozyten war bisher noch nicht bekannt. Unsere Untersuchungen zeigen, dass eine Perturbation von COBLL1 zu einer fehlerhaften Aktinfilamentierung während der Adipogenese, gefolgt von einer niedrigeren Insulin-stimulierten Glukoseaufnahme, Triglyzeridspeicherung und stimulierten Lipolyse, führt. Unsere Experimente zeigen eine mögliche mechanistische Grundlage für den Zusammenhang zwischen dem COBLL1/GRB14 Lokus und T2D. Wir zeigen eine Verbindung zwischen der Expression von COBLL1 und dem nicht kodierenden T2D Signal 2q24.3, indem wir die regulatorische Variante rs6712203 und den am T-Nicht-Risiko Allel bindenden Transkriptionsfaktor POU2F2 identifizieren. Darüber hinaus beschreiben wir zum ersten Mal den Einfluss von COBLL1 auf die Aktinfilamentierung in Adipozyten, was zu einer verringerten Adipogenese, Lipidspeicherung und stimulierten Lipolyse beitragen kann - Risikofaktoren für Insulinresistenz und T2D