Non-targeted approach towards determination of novel markers for Nitrofurazone abuse in shrimp farming

Abstract

Antibiotic use in farming operations can have repercussions when it comes to antibiotic resistant bacteria and to antibiotic residues consumed by the general population. Nitrofurazone is a synthetic broad-spectrum antibiotic of the nitrofuran family that has been banned since the early 1990’s by most regulatory agencies due to increasing evidence of carcinogenicity. Due to the quick metabolism of nitrofurans by host bodies, their detection relies on the analysis of their common metabolites. In the case of nitrofurazone, semicarbazide is used to monitor its use in farm animals. However, it has been shown that SEM can occur due to sources other than nitrofurazone abuse, and of particular importance, it can occur naturally in shrimp and other crustaceans. This comes to question the validity of semicarbazide analysis for nitrofurazone monitoring.No studies had discussed the possibility of thermal degradation of nitrofurazone up to date. This study monitored the degradation of nitrofurazone at 100C at two pH levels (7 and 1.3) with a “dilute and shoot” non-targeted methodology in an HPLC-QTOF system in an attempt to better understand the stability of the different bonds within the molecule. This allowed not only to verify that nitrofurazone does degrade significantly at 100C, but also to monitor the appearance of different entities that could be correlated with thermal treatment. Ten compounds were found to increase with cooking time and their fragmentation patterns were studied to attempt to determine their structures. The Agilent Molecular Structure Correlator software provided matches for six of these ten compounds. For two of these there was structural similarity with the parent compound, and for one a theoretical degradation mechanism was developed to discuss the degradation of nitrofurazone into [(Furan-2-yl)methylidene]hydrazine. However, once a standard for this compound was obtained, its retention time and fragmentation pattern did not match the entity observed in the degradation experiment. Despite not confirming any entity with a standard, this experiment still discovered several masses that increase as thermal treatment of nitrofurazone increases.A non-targeted metabolomic experiment was designed to compare the observed metabolites between shrimp treated with nitrofurazone and control shrimp using an HPLC-QTOF system. Four extractions were tested with the shrimp matrix and ultimately an acetonitrile/water (80:20, v/v) extraction was selected for all sample analysis. Data treatment revealed multiple entities that increased with nitrofurazone treatment but ultimately a single molecule that was present in all treated samples and absent in all control samples was not found. This meant that a replacement for SEM was not found using this extraction and data treatment but does not necessarily signify that it does not exist. More non-targeted extractions should be tested in the search of a replacement for semicarbazide. Despite this, the differences between control and treated shrimp were exploited to build a Partial Least Squares statistical model that could potentially differentiate between treated and control shrimp. Initial cross-validation of the model showed that it had up to 98% accuracy in differentiating between the sample groups, but when an external validation sample set was used to test the model, it was unable to differentiate between sample groups. This result is likely due to extraction and analysis variability and a larger sample set would be necessary to minimize this in order to build a more robust model. Overall, this work has tested the application of a non-targeted methodology for the discovery of a new metabolite to monitor NFZ abuse. Although this metabolite was not identified, it still allowed to rule out a solvent mix for this purpose and allowed to better understand the conditions necessary for the development of a robust model capable of differentiating between treated and control samples.L’utilisation d’antibiotiques dans l’élevage animal peut avoir des répercussions quant au développement de bactéries résistantes aux antibiotiques et aux résidus d’antibiotiques consommés par la population. Le Nitrofurazone (NFZ) est un antibiotique synthétique à large spectre de la famille des nitrofuranes qui a été interdit par la plupart des autorités sanitaires depuis 1990 à cause de preuves croissantes de leur cancérogénicité. À cause du métabolisme rapide des nitrofuranes par les organismes traités, leur détection repose dans l’analyse de leurs métabolites les plus communs. Pour le NFZ, le métabolite est le semicarbazide (SEM). Néanmoins, il a été prouvé que SEM peut être formé depuis sources autres que le traitement avec le NFZ et en particulier, il peut apparaitre naturellement dans les crevettes. Ces aspects remettent en question la validité de l’analyse du SEM pour la surveillance du NFZ. Aucune étude n’a été publiée dans la littérature à propos de la dégradation thermique du NFZ. Dans cette étude, la dég. du NFZ a été évaluée dans l’eau à 100C a deux pH (7 et 1.3) par une méthodologie non-ciblée reposant sur l’injection directe dans un système HPLC-QTOF pour comprendre la stabilité des différentes liaisons de la molécule en question. Ceci a permis non seulement de vérifier qu’en effet le NFZ se dégrade à 100C, mais que plusieurs entités chimiques apparaissent en corrélation avec le traitement thermique. 10 composés dont l’intensité augmente avec le traitement ont été trouvés, et leur MS/MS a été étudié pour essayer de déterminer leurs structures. Le logiciel MSC d’Agilent a permis d’attribuer une structure pour 6 des 10 composés. Pour 2 d’entre eux, une relation avec la structure du NFZ a pu être suggérée, incluant un mécanisme théorique qui expliquerai la dégradation du NFZ en [(Furan-2-yl)methylidene]hydrazine. Néanmoins, une fois que le standard de cette molécule fut obtenu, le temps de rétention et le MS/MS ne correspondaient pas à ceux de l'echantillon. Bien que les structures exactes ne puissent être présentement confirmées, cette expérience a mis en évidence plusieurs composés qui augmentent avec le traitement thermique de NFZ.Une étude non-ciblée a été conçue pour comparer les métabolites observés entre des crevettes traitées avec NFZ et d'autres du traitement contrôle, en utilisant un système HPLC-QTOF. 4 extractions ont été testées dans la matrice des crevettes et ultimement une extraction avec ACN/H2O (80:20, v/v) a été choisie pour les échantillons. L’analyse de données a révélé plusieurs entités qui augmentaient avec le traitement de NFZ, mais aucune des molécules présente dans tous les échantillons traités n’est absente dans tous les échantillons contrôles. Ceci veut dire qu’une alternative au SEM n’a pas été trouvée avec la présente extraction et le traitement de données, mais cela ne veut pas dire qu’elle n’existe pas. D’autres extractions non-ciblées devraient être testées dans le futur. Les différences dans les métabolomes extraits pour les crevettes traitées ont été exploitées pour développer un modèle à base de PLS qui pourrait potentiellement différentier entre des crevettes traitées et des crevettes contrôles. Une validation croisée a vérifié que le modèle avait une exactitude de jusqu’à 98% pour différentier les types d’échantillons, mais quand une validation avec un groupe externe fut testée, il ne pouvait plus différentier les groupes. Ceci est probablement à cause de la variabilité dans l’extraction et un groupe d’échantillonnage plus grand pourrait minimiser cette erreur et resulter dans un modèle plus robuste. Ce travail a testé l’application d’une analyse non-ciblée pour la découverte d’un nouveau métabolite pour la surveillance du NFZ. Même si ce métabolite ne fut pas identifié, cela a permis d’exclure ces conditions pour ce propos et de mieux comprendre les conditions nécessaires pour le développement d’un modèle robuste pour différencier des échantillons traités et contrôle