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Recombinaison Génétique à l'Échelle de la Molécule Unique : Micromécanique des Jonctions de Holliday et Activité du Complexe RuvAB

By Alexandre Dawid

Abstract

This work is a study, at the single molecule level, of the recombination intermediate produced<br />when two homologous DNA molecules exchange their single-strands : the Holliday junction.<br />First, we show that a negative torque applied on a DNA molecule with an entirely palindromic<br />sequence leads to the formation of a Holliday junction. The strand exchange can then be directly driven<br />by mechanical torsion. Using this technique we accessed experimentally, and for the first time with such<br />a precision, to the value in solution of the helical pitch of DNA : 3.61 ± 0.03 nm/tr.<br />We also studied the kinetics of the strand exchange process under the influence of mechanical<br />constraints and in the presence of magnesium ions. We then developed a simple model of the mechanical<br />behavior of the Holliday junction under mechanical constraint in order to interpret the experimental data.<br />The single-strand exchange can also be catalyzed by specific enzymes. The mechanical work<br />produced during this activity defines these proteins as molecular motors. The second part of this work<br />concerns the study, at the single molecule level, of one of these enzymes : the RuvAB complex of the<br />bacteria Escherichia coli.<br />Firstly, we characterized the RuvAB migration activity on single Holliday junctions. In particular,<br />we found that the complex is highly processive and we estimated its speed at 37◦C and in presence<br />of 1 mM ATP : ∼ 43 base pairs exchanged per second.<br />Furthermore, we have shown that the RuvA subunit alone catalyzes the exchange of base-pairs<br />that occurs at the branch point of the structure.Ce travail présente tout d'abord l'étude, à l'échelle de la molécule individuelle, de l'intermédiaire<br />de recombinaison formé par l'échange de simples brins entre deux molécules d'ADN homologues : la<br />jonction de Holliday.<br />Nous montrons tout d'abord qu'il est possible, à partir d'un ADN portant une séquence entièrement<br />palindromique, de former une jonction de Holliday en appliquant une torsion négative. Une fois<br />la jonction formée, la torsion permet également de contrôler de façon directe l'échange des simples brins.<br />Cette technique nous a permis d'accéder expérimentalement, avec une très bonne précision, à la valeur<br />en solution du pas hélicoïdal de l'ADN : 3.61 ± 0.03 nm/tr.<br />Ensuite nous avons étudié, en présence d'ions magnésium, la cinétique de migration de la jonction<br />de Holliday sous l'influence des contraintes mécaniques. Une modélisation simple du comportement<br />de la jonction de Holliday vis-à-vis des contraintes mécaniques a été développée permettant d'expliquer<br />leur influence sur le mécanisme de migration.<br />L'échange des simples brins peut également être catalysé par certaines enzymes. Le travail<br />mécanique développé au cours de cette activité catalytique fait de ces enzymes des moteurs moléculaires.<br />La seconde partie de ce travail porte sur l'étude en molécule unique d'un tel moteur : le complexe RuvAB<br />de la bactérie Escherichia coli.<br />Nous avons tout d'abord caractérisé la migration de jonctions de Holliday individuelles sous<br />l'action du complexe RuvAB. Nous avons notamment montré la très grande processivité du complexe et<br />nous avons pu estimer la vitesse de migration à 37◦C et en présence d'1 mM d'ATP : ∼ 43 paires de<br />bases échangées par seconde.<br />D'autre part, et pour finir, nous avons mis en évidence le rôle catalytique de la sous-unité RuvA<br />dans l'échange des paires de bases au niveau du point de branchement

Topics: Single molecule, magnetic tweezers, Holliday junction, recombination, Molécule unique, pince magnétique, jonction de Holliday, RuvA, RuvAB, recombinaison, [PHYS.PHYS.PHYS-BIO-PH] Physics [physics]/Physics [physics]/Biological Physics [physics.bio-ph]
Publisher: HAL CCSD
Year: 2005
OAI identifier: oai:HAL:tel-00012063v1
Provided by: Hal-Diderot
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