Mode of action analysis of the synthetic epothilone Sagopilone

Abstract

Das vollsynthetische Epothilon Sagopilon wird derzeit in der klinischen Phase II zur Behandlung solider Tumore erprobt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der molekulare Wirkmechanismus Sagopilons im Vergleich zu anderen Epothilonen und ähnlich wirkenden Taxanen untersucht. Ziel war es, Biomarker zur Abschätzung des Therapieerfolgs zu identifizieren. Ein weiteres Ziel war die rationale Identifizierung und mechanistische Beurteilung von Kombinationsstrategien. Als ausschließliche Angriffsstelle Sagopilons wurde Tubulin, Baustein der Mikrotubuli, identifiziert. Sagopilon stabilisiert Mikrotubuli in stärkerem Maße als Taxane und andere Epothilone. Dies fördert die Bildung von de novo Nukleationszentren für Mikrotubuli und führt zur Bildung multipolarer statt bipolarer mitotischer Spindeln. Die Teilung tripolarer Spindeln resultiert in vitalen Zellen mit vermindertem, aneuploiden DNA-Gehalt, die seneszenzähnlich in der G1-Phase arretiert sind. Diese Art der Proliferationshemmung wurde in den Tumorzellinien SKBR3, MDA-MB231, MCF7, T47D, A549 und MDA-MB435s bei subnanomolaren Sagopilonkonzentrationen beobachtet. Das Risiko, dass Zellen aus dem G1-Arrest austreten und erneut proliferieren, steigt mit ihrem Polyploidisierungsgrad. Unter niedrigen Paclitaxelkonzentrationen hingegen bilden sich weniger stabile tripolare Spindeln, stattdessen auch monopolare Spindeln, die nach Mitoseabbruch zu vitalen, tetraploiden Zellen führen können. Höhere Sagopilon- und Paclitaxelkonzentrationen stören die Mikrotubulidynamik derart, das die Zellen in der Mitose blockiert werden. Dies führt meist zu Apoptose, jedoch zellinienabhängig auch zu fehlerhaften Mitosen oder Polyploidisierung. Zwischen verschiedenen Tumorzellinien und zwischen Zellen der gleichen Linie wurden Unterschiede im Verlauf nach dem mitotischen Arrest beobachtet. Entscheidend war hierbei die Stärke des mitotischen Arrests sowie die Balance pro-und antiapoptotischer Faktoren. In einem 300 Gene und vier Zellinien umfassenden RNAi-Screen wurden Defekte im mitotischen Kontrollpunkt des Spindelaufbaus (Spindle assembly checkpoint) als Ursache von Resistenz gegen die Apoptoseinduktion infolge mitotischen Arrests identifiziert. Potentielle Resistenz-Biomarker sind SAC-Defekte, wie z. B. Mutationen in der zentralen Kinase BUB1B, sowie ein reduziertes Apoptosepotenzial der Zellen durch niedrige Expression proapoptotischer Proteine (z. B. Bak, Caspasen) und erhöhte Expression antiapoptotischer Proteine (z. B. BCL2). Chromosomale Heterogenität und Polyploidisierung zeugen von einer erhöhten Toleranz gegenüber aberranten Mitosen und sind daher potentielle prädiktive Resistenzbiomarker. Die häufigste Resistenzursache gegen Taxane ist die Hochregulation von ABC-Transportern. Der RNAi-Screen bestätigte erneut, dass Sagopilon kein Substrat für ABC-Transporter ist. Außerdem verstärkte die siRNA-vermittelte Herabregulation epothilonmetabolisierender Enzyme nicht die Wirkung von Sagopilon in den untersuchten Tumorzellinien. Ein rationaler Kombinationsansatz ist die Verstärkung des sagopilon-induzierten mitotischen Arrests, z. B. durch die Hemmung von Kinesinen, den Motorproteinen der mitotischen Spindel. Entscheidend für die Kombinationswirkung von Sagopilon und Kinesininhibition ist der Aktionszeitpunkt der Kinesine. So wirken Sagopilon und die Hemmung des in der Prophase aktiven Kinesins KIF11 (Eg-5) antagonistisch, während Sagopilon und die Hemmung des in der Meta-phase aktiven Kinesins KIF2C (MCAK) synergistisch wirken. Für die Klinik wird für Sagopilon ein breiteres Anwendungsspektrum als für vergleichbar wirkende Taxane erwartet. Ein Resistenzrisiko besteht für polyploide und chromosomal heterogene Tumore. Die zytotoxische Wirkung Sagopilons kann vermutlich durch Kombination mit Inhibitoren des Kinesins KIF2C gesteigert werden.Chemotherapy of cancers is complicated by tumor heterogeneity and development of resistances. In the clinic, combination therapies are usually employed to overcome these obstacles. Sagopilone, a fully synthetic epothilone, is currently evaluated in clinical phase II trials. Here, the molecular mode of action of sagopilone was compared to that of other epothilones and the functionally related taxanes. This work aimed to identify biomarkers predictive of tumor response to sagopilone. Another aim was to identify rational combination strategies and to evaluate these mechanistically. Tubulin was identified as unique target of sagopilone. Sagopilone stabilizes microtubuli more effectively than taxanes and other epothilones. This leads to the formation of centrosome-independent microtubule-organizing centers and results in multipolar instead of bipolar mitotic spindles. Tripolar mitosis produces vital cells with reduced, aneuploid DNA-content arrested in a senescence-like G1-state. This mechanism of proliferation inhibition was observed in the tumor cell lines MCF7, T47D, MDA-MB231, SKBR3, A549 and MDA-MB435s at subnanomolar sagopilone concentrations. The risk of cells escaping the G1-arrest increases with polyploidy, as seen for MCF7-cells. Paclitaxel on the other hand causes monopolar spindles besides multipolar ones. After mitotic exit, this leads to vital, proliferating tetraploid cells. Higher concentrations of sagopilone and paclitaxel perturb microtubuli dynamics to the point of mitotic arrest. Mitotically arrested cells usually undergo apoptosis but may also undergo aberrant mitosis or mitotic slippage and endoreduplication. Cell lines and cells of the same line differed in the outcome following mitotic arrest depending on the strength of the mitotic arrest and a balance of proand anti-apoptotic factors. An RNAi-modifier screen comprising 300 genes in four cell lines identified defects of the spindle assembly checkpoint (SAC) to cause resistance against sagopilone-induced mitotic arrest and apoptosis. Potential biomarkers for resistancy are SAC-defects like mutations in the central SAC-kinase BUB1B or low apoptotic potential due to high expression of anti-apoptotic proteins such as BCL2 and low expression of pro-apoptotic proteins like Bak or Caspases. Chromosomal heterogeneity and polyploidy are also potential biomarkers of resistance since they imply an increased tolerance for aberrant mitosis. The most frequent development or resistancy against taxanes is the upregulation of ABC-Transporters. The RNAi-modifier screen showed yet again that sagopilone is not a substrate of ABC-transporters. In addition, sagopilone is not metabolized by the analyzed tumor cells. The RNAi-modifier screen also identified the enhancement of sagopilone-induced mitotic arrest by inhibition of mitotic kinesins, as potential combination strategy. The combination effect depends on the action of individual kinesins within the mitotic progression. On one hand, the combination of sagopilone and inhibition of the prophase kinesin KIF11 (Eg-5) is antagonistic. On the other hand, sagopilon and inhibition of the metaphase kinesin KIF2C (MCAK) synergize. Clinically, sagopilone is expected to be show broader activity than taxanes. Polyploid and chromosomal heterogeneous tumors are likely to have an increased intrinsic risk for resistancy. Combination with inhibitors of kinesin KIF2C is likely to enhance the cytotoxicity of sagopilone