Untersuchung der Initiation der Surfactin-Biosynthese in Bacillus subtilis OKB 105

Abstract

Die Biosynthese des zyklischen Lipopeptids Surfactin in Bacillus subtilis OKB 105, das aus sieben Aminosäuren und einer ß-Hydroxy-Fettsäure besteht, wird durch die drei Enzyme SrfA, SrfB und SrfC katalysiert. Die Synthese erfolgt nicht-ribosomal nach dem Multiple-Carrier-Modell, indem die Substrataminosäuren in einem zweistufigen Prozeß aktiviert werden. Versuche mit den aufgereinigten Surfactin-Synthetase-Teilenzymen zeigten, daß die Synthese von Surfactin ausschließlich mit diesen drei Enzymen möglich ist und die früher postulierte Acyltransferase E3 für die Initiation nicht benötigt wird. Die Initiation der in vitro-Surfactin-Biosynthese wurde insbesondere an dem gentechnisch hergestellten Glutaminsäure-aktivierenden Modul und entsprechenden Mutanten getestet. Es sollte auf diese Weise ausgeschlossen werden, daß an den aufgereinigten Surfactin-Synthetase-Teilenzymen eine Acyltransferase assoziiert vorlag, die in der Lage ist, die in vitro-Surfactin-Biosynthese zu katalysieren. Es konnte auf diese Weise die Bildung der linearen und laktonisierten Initiationsprodukte ß-HA-CoA-[14C]Glu gezeigt werden. Durch die Zugabe von E3 wurde die Bildung der enzymgebundenen Initiationsprodukte gehemmt. Für Funktionsstudien wurde SrfD heterolog in Escherichia coli als Fusionsprotein mit dem Maltose-bindenden Protein exprimiert und durch Affinitätschromatographie gereinigt. Es wurde zur Herstellung des anti-MBP-SrfD-Antikörpers verwendet, mit dessen Hilfe erstmals in den E3-Fraktionen SrfD immunchemisch nachgewiesen wurde. Die Funktion von SrfD ist noch nicht aufgeklärt. Es wird jedoch vermutet, daß es an der Zyklisierung von Surfactin beteiligt ist. Dies könnte die beobachtete Stimulierung der in vitro-Surfactin-Biosynthese durch E3-Fraktionen erklären. Die Nukleotidsequenz des 40 kDa Proteins aus der E3-Fraktion von B. subtilis OKB 105 wurde ermittelt und durch einen Sequenzvergleich als das Gen yurP identifiziert. Das daraus resultierende Protein zeigt Homologien zu dem Protein MocD aus Agrobacterium tumefaciens, das am Katabolismus von Mannopin beteiligt ist. MocD katalysiert wahrscheinlich die Spaltung des Zwischenproduktes Santhopin in Glutamin und Mannose. YurP wurde für Funktionsstudien heterolog in Escherichia coli exprimiert und dabei zur Aufreinigung durch Affintätschromatographie mit sechs Histidinresten markiert. N-His6-YurP zeigte jedoch keinen Einflu