Atomic force microscopy on biological materials : biosensors and nanotools

Abstract

Na primeira parte deste trabalho, nós investigamos o processo de crescimento de um biofilme de bactérias (Xylella fastidiosa) inoculadas sobre lamínulas de vidro. O tamanho e a distância entre os biofilmes foram estudados por imagens de microscopia óptica; e uma análise fractal foi realizada usando conceitos de escala e imagens de AFM. Observamos que biofilmes diferentes mostram características fractais semelhantes, embora as variações na morfologia possam ser identificadas para diferentes estádios de crescimento do biofilme. Dois tipos de padrões estruturais são identificados através da dimensão fractal (Df) sugerindo que o crescimento do biofilme pode ser entendido como o modelo de Eden nos estágios de formação e no final, enquanto para o estágio de maturação aparecem evidências do modelo DLA (diffusion-limited aggregation). Estes resultados foram correlacionados à formação da matriz do biofilme que pode dificultar a difusão dos nutrientes e por isso criar condições para um crescimento DLA. Ainda com o AFM, fizemos medidas de espectroscopia de força para estudar a interação específica entre antígeno-anticorpo relacionados ao vírus CTV (citrus tristeza virus). Para tanto foi realizado o estudo da imobilização deste material biológico nas superfícies da ponta do AFM, e nos substratos planos de Si e InP. Usamos para isto imagens topográficas de AFM, imagens de microscopia eletrônica e ensaios imunoquímicos de ELISA; com isso pudemos confirmar que tanto o antígeno quanto o anticorpo foram imobilizados e que eles continuavam em seus estados nativos. Com as medidas de espectroscopia de força, detectamos que a diferença de força entre as interações específicas (antígeno-anticorpo) e não-específicas (antígeno-antígeno) foi de aproximadamente 60%. Utilizamos a mesma rotina de preparação em substrato de InP para o desenvolvimento de um biossensor baseado no funcionamento de um transistor FET (field-effect transistor). Os anticorpos foram imobilizados na superfície do semicondutor, enquanto doses de antígenos livres eram adicionadas a uma célula líquida que mantinha contato com esta superfície. Com curvas de corrente vs tensão em regiões lineares do dispositivo, estudamos a resposta, a sensibilidade e a especificidade do sensor, obtendo resultados promissores indicando viabilidade no desenvolvimento e no uso do mesmo. Por fim, estudamos a durabilidade de pontas de AFM com CNT (carbon nanotube) encapsulados com carbono amorfo numa amostra padrão semicondutora de pontos quânticos, além de estudar a sua estabilidade em meio líquido. Duas pontas foram estudadas, uma fabricada pelo nosso grupo e outra comercial, fornecida pela empresa americana CDI (Carbon Design Inovation). Utilizamos ferramenta de FT (fourier transform) para o estudo da resolução das pontas em imagens topográficas de AFM, e verificamos que ambas as pontas duraram mais de 400 imagens tendo uma perda da resolução de ~ 7% no ar e de ~ 5% ¿ em relação às medidas a seco ¿ em meio líquido, mostrando a viabilidade de seu uso no estudo de amostras biológicasWe have investigated the growth process of Xylella fastidiosa biofilms inoculated on glass. The size and the distance between biofilms were analyzed by optical microscopy images; a fractal analysis was carried out using scaling concepts and Atomic Force Microscopy (AFM) images. We observed that different biofilms show similar fractal characteristics, although morphological variations can be identified for the different biofilm stages. Two types of structural patterns are suggested from the observed fractal dimensions Df: and suggest that the biofilm growth can be understood as an Eden model in the initial and final stages, while diffusion-limited aggregation (DLA) seems to dominate the maturation stage. Changes in the correlation length parallel to the surface were also observed; these results were correlated to the biofilm matrix formation which can hinder nutrient diffusion and thus create conditions to drive DLA growth. Atomic force spectroscopy was used as a method to investigate the specific antibody-antigen binding using proteins of the CTV (citrus tristeza virus). Subsequently, the chemical processes of covalent immobilization of the used biomolecules to different solid supports ¿ Si3N4 AFM Tips, Si and InP plane substrates ¿ was developed and characterized. The verification of the chemical binding process by different methods like AFM topography experiments, electron microscopy and ELISA immunochemical assays showed a successful immobilization of the biomolecules and that they were still in their native state. The analysis of the spectroscopic force data showed a significant difference in binding force between the specific antibody-antigen complexes and the non-specific controls (approximately 60%). The same chemical immobilization process was used to bind biomolecules to solid InP supports to develop a biosensor based on the field-effect transistor (FET) principle. The same antibodies, as used in atomic force experiments, were immobilized covalently to the semiconductor surface. The antibody-antigen complexation by adding the specific antigens to the functionalized surface was detected through changes in the current vs tension curves of semiconductor sample. The characterization of the electrochemical response, the molecular sensibility and the specificity of this biosensor showed a suitable method to detect specific molecular binding events. Further, the durability and stability of AFM tips with bonded carbon nanotubes with encapsulated amorphous carbon was studied on a standard semiconductor sample with quantum dots in air and liquid environment. Two different CNT AFM-tips were studied within this study in acoustic mode. One was assembled in our group and the other tip was provided by the american CDI (Carbon Design Innovation) company. The topographic AFM images were analyzed via FT (Fourier Transform) to study the spatial resolution of these tips. In air, both types of CNT tips showed a minor resolution decrease of approximately 6% after 400 topographic scans. In liquid environment an overall 10% lower spatial resolution of the tips was observed compared to the resolution in air which nevertheless makes these CNT AFM-tips suitable for experiments with native biological sample