Identification of new flagellar antigen and phase variation in Escherichia coli isolated from animals and food

Abstract

Escherichia coli é um membro comensal da microbiota de animais, porém podem causar doenças desde diarréias até sepses. A caracterização dos seus antígenos de superfície O (somático) e H (flagelar) auxilia na determinação de linhagens patogênicas dentro da espécie. Contudo, algumas bactérias não expressam flagelo in vitro, demonstrado que a amplificação do gene fliC, a análise dos fragmentos de polimorfismo (PCR-RFLP) e sequenciamento podem ser utilizadas para identificação dos antígenos H, em substituição à sorologia convencional. Até meados de 1980, pensava-se que, diferentemente da Salmonella, E. coli possui um único gene para expressão de flagelina (fliC), mas algumas amostras podem conter genes para expressão de flagelina flkA, fllA, flmA, flnA e fljA (repressor de fliC). Em nosso trabalho, analisamos 31 amostras de E. coli isolados de animais e alimentos que apresentavam o fenótipo HNT em ensaios de sorologia. Utilizamos PCR-RFLP e sequenciamento para descrever novos genes para flagelina, da qual foram obtidos antissoros. Identificamos por PCR e sequenciamento os genes responsáveis pela variação de fase fljA, flkA e flmA, realizamos experimentos de motilidade para determinar a variação de fase flagelar e detectar a expressão dos genes através de RT-PCR. Dezessete amostras tiveram seus antígenos H caracterizados, sendo nove caracterizadas por PCR-RFLP: H2 (duas amostras) H16 (duas amostras), H34 (três amostras), H33 (uma amostra) e H38 (uma amostra). Na análise de sequenciamento identificamos duas amostras portadoras do gene fliCh25, duas amostras fliCh7 e uma amostra apresentando fliCh32. Três novos genes para flagelina foram descritos: fliCh2', fliC4c, fliC40c. Identificamos o gene fljA em duas amostras HNT (3C e 4C) e na amostra padrão H35. O gene das amostras HNT apresentaram homologia ao fljA de Salmonella enterica, cuja variação de fase é bem estabelecida. As amostras padrão H11, H35, H40 e H47, bem como as amostras HNT 3C e 4C foram positivas para o gene flmA. As amostras padrão H3 e H53 são portadoras do gene flkA, contudo apenas a amostra H53 apresentou fljA. A amostra H54 é portadora de fljA e flmA. Nenhuma amostra H padrão mostrou variação de fase, diferentemente da literatura, sugerindo a perda da capacidade de variar a fase flagelar. A amostra 4C mostrou variação de fase positiva quando induzida em meios de cultura contendo antissoros anti-H48, anti-H54 e anti-H4C. Do mesmo modo, a detecção dos RNAm em diferentes condições de cultura confirmou a variação de fase. Como resultado um esquema de identificação para detecção de grupos de antígenos H e identificação de fliC foi testado. A técnica de fliC-RFLP provou ser eficiente e rápida, auxiliando a sorologia clássica para detecção de antígenos H de E. coli. Um modelo geral de variação de fase da amostra 4C é expresso por fliCoff + flmAon ? fliCon + flmAoff. Além disso, nós verificamos que a amostra 4C apresenta um gene novo para expressão de flagelina. Este trabalho é pioneiro em relação à variação de fase flagelar, demonstrando uma nova associação entre os antígenos H48 e H54Escherichia coli are a species of microflora, and characterization of the cell surface lipopolysaccharide O antigen and the flagellar H antigen allow the grouping of pathogenic clones within this species. Moreover, some bacteria in vitro do not obtain to express its flagella, demonstrated that PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and sequencing analysis has been used for the identification of these antigens, in substitution of traditional serology. Moreover, until middle of years 80, are believed, differently of the Salmonella, E. coli possesss an only gene for flagelin expression (fliC), but some s/strains can contain genes for flagellin expression flkA, fllA, flmA, flnA and fljA (repressor of fliC). In this work, we analyzed 31 strains of E. coli isolated from animals and foods that presented HNT phenotype in serology assays. We use PCR-RFLP and sequencing to describe new genes for flagellin, of which antiserum were obtained. We identify for PCR and sequencing the genes for phase variation fljA, flkA and flmA, we carry through motility experiments to determine the flagellar phase variation and to detect the expression of the genes (RNAm) through RT-PCR. Seventeen strains had had its H antigen characterized and nine of then were characterized for PCR-RFLP: H2 (two strains) H16 (two strains), H34 (three strains), H33 (one strain) and H38 (one strain). Through sequencing analysis we identify to two carrying strains of the gene fliCh25, two strains fliCh7 and one strain presenting fliCh32. Three new genes for flagellin had been described: fliCh2', fliC4c, fliC40c. Using PCR and sequencing, we identify fljA gene in two strains HNT (3C and 4C) and in the H35 control strain. The HNT genes showed homology to fljA of Salmonella enterica, whose variation of phase well is established. The control strains H11, H35, H40 and H47, as well as HNT 3C and 4C strains were positive for flmA gene. The control strains H3 and H53 are carrying of flkA gene, however only the H53 strain presented fljA. The H54 control strain is carrying of fljA and flmA. No H control strain showed phase variation, differently of literature, suggesting the loss of the capacity to flagellar phase variation. The 4C strain showed positive phase variation when cultured with antiserum anti-H48, anti-H54 and anti-H4C. In a similar way, the detention of RNAm in different conditions of culture confirmed the phase variation. As a result, an identification scheme was tested to deduce H antigen groups and new genes of fliC. The fliCRFLP technique proved to be faster than classic serotyping for the deduction of the E. coli H antigen, characterizing the antigens with few days and indicating new putative genes. Thus, a general model for flagellar phase variation in 4C strain can be expressed as fliCoff + flmAon ? fliCon + flmAoff. In addition, we found that strains 3C and 4C express unidentified flagellin antigens. This is the first report of flagellar phase variation in wild E. coli strains. We have also provided evidence that strain 4C, identified here for the first time, expresses three flagellar antigens, H48, H54 and a previously unidentified flagelli