Study of the proteins HrpF and AvrXacE2 in pathogenicity of Xanthomonas axonopodis pv. citri

Abstract

A bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é o agente causador do cancro cítrico, doença que leva a severas perdas econômicas devido à contaminação e à erradicação de plantas de citros. Com o seqüenciamento completo do genoma de Xac, vários genes supostamente envolvidos com a patogenicidade de Xac foram identificados. Os genes ligados à resposta de hipersensibilidade (hrp) e avirulência (avr) em geral estão relacionados à patogenicidade de Xanthomonas, entretanto, poucos estudos funcionais destes genes de Xac foram feitos. Foram construídas linhagens mutantes de Xac para a perda de função dos genes hrpF e avrXacE2 e, nas análises in vivo, foi verificado que hrpF está envolvido na patogenicidade de Xac e é essencial para a manifestação dos sintomas primários da doença. A mutação de avrXacE2 não provocou alterações na capacidade de Xac em provocar os sintomas do cancro, portanto, este gene não parece ser essencial para a patogenicidade da bactéria, podendo não estar envolvido diretamente na patogenicidade de Xac. Os genes hrpF e avrXacE2 foram clonados em vetores de expressão e foram realizados testes de indução da expressão destas proteínas em sistemas heterólogos. Somente a proteína AvrXacE2 foi expressa, purificada e submetida a teste de interação com as proteínas citoplasmáticas da linhagem mutante de Xac para o gene avrXacE2. Os testes de interações não confirmaram a identificação de proteínas com afinidade específica pela proteína recombinante AvrXacE2. A proteína HrpF não foi super-expressa em sistema heterólogo. Nas análises de proteoma comparativo da linhagem de Xac selvagem versus linhagem mutante para o gene hrpF, foram detectadas alterações na expressão de proteínas citoplasmáticas e "pericelulares". Com base nas observações pode-se supor que HrpF possa influenciar processos celulares relacionados à respostas à situações de estresse e não somente atuar na translocação de moléculas efetoras via T3SS. A partir do que foi exposto neste trabalho, sugere-se que as técnicas de estudos funcionais de genes e análises proteômicas podem conjuntamente permitir que novos mecanismos relacionados a patogenicidade de Xac sejam interpretados. Com os mutantes produzidos neste estudo, espera-se criar condições para novos ensaios funcionais visando a melhor compreensão da patogenicidade de Xac e buscar novas formas de combate ao cancro cítricoThe bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causative agent of the citrus canker disease, which leads to economic losses due the contamination and erradication of citrus plants. The complete sequencing of its genome identified a number of genes supposedly involved with pathogenicity. Genes that code for hipersensitivity response (hrp) and avirulence (avr), in general, are related to the pathogenicity of Xanthomonas, however, only a few functional studies of these genes in Xac have been made. Here we report findings based on genomics and proteomics methods for Xac. Mutant strains of Xac for genes hrpF and avrXacE2 and in vivo assays demonstrated that hrpF is strongly involved in the pathogenicity of Xac and is essential for the manifestation of the primary symptoms of the citrus canker. On the other hand, the lack of avrXacE2 expression did not result in modifications in the capacity of Xac to elicite the symptoms of canker, therefore, this gene does not seem to be essential for the pathogenicity of the bacterium. The genes hrpF and avrXacE2 were cloned in expression vectors and tests of induction of the expression of these proteins in heterologous systems were carried out. The protein AvrXacE2 was expressed, purified and tested on interaction assays with cytoplasmic proteins of the mutant of Xac for the gene avrXacE2. The tests of interactions had not confirmed the identification of proteins with specific affinity for the recombinant protein AvrXacE2. The protein HrpF was not overexpressed in heterologous system. In the comparative proteome of the wild versus mutant strains for hrpF, modifications in the cytoplasmic protein expression and "pericellular" expression levels were detected. We postulate that, besides acting as a translocator of molecules through T3SS, HrpF may influence stress-related cellular responses. Thus, it is an opportune time to highlight the new and different ways in which HrpF serves Xac function. Moreover, we can assume that the techniques of functional genomics and proteomics analyses will clarify the mechanisms of pathogenicity used by Xac to cause citrus canker and, thus, enable the search for additional information to control the diseas