Utilização da técnica de PCR em tempo real para avaliação de dois métodos de extração de DNA a partir de alimentos

Abstract

A extração de DNA é uma etapa crítica na análise de organismos geneticamente modificados em alimentos por PCR em tempo real. Neste trabalho, os métodos CTAB e DNeasy forneceram preparações de DNA em quantidade e com qualidade a partir de amostras de proteína texturizada de soja, fórmula infantil e extrato de soja. Em relação ao Material de Referência Certificado contendo 5% de soja RoundupReady® , nenhum dos métodos forneceu DNA de boa qualidade. Entretanto, o teste de diluição realizado nos extratos de CTAB não demonstrou interferência de substâncias inibidoras. As eficiências das amplificações do alvo lectin não foram estatisticamente diferentes e os coeficientes de correlação (R2) demonstraram alto grau de correlação entre o número de cópias e os valores de Ct. A ANOVA demonstrou ajuste das curvas de regressão e ausência de desvios significativos. As eficiências das amplificações do alvo p35S, utilizando extratos DNeasy, não foram estatisticamente diferentes e os valores de R2 ficaram acima de 0,98, sem desvios de linearidade. Dois valores de R2, utilizando extratos CTAB, foram menores que 0,98, correspondendo a menor grau de correlação edesvio de linearidade em uma corrida. A análise comparativa dos Cts dos alvos p35S e lectin não demonstrou diferenças significativas entre as curvas analíticas da amplificação de cada alvo.The DNA extraction is a critical step in Genetically Modified Organisms analysis based on real-time PCR. In this study, the CTAB and DNeasy methods provided good quality and quantity of DNA from the texturized soy protein, infant formula, and soy milk samples. Concerning the Certified Reference Material consisting of 5% Roundup Ready® soybean, neither method yielded DNA of good quality. However, the dilution test applied in the CTAB extracts showed no interference of inhibitory substances. The PCR efficiencies of lectin target amplification were not statistically different, and the coefficients of correlation (R2) demonstrated high degree of correlation between the copy numbers and the threshold cycle (Ct) values. ANOVA showed suitable adjustment of the regression and absence of significant linear deviations. The efficiencies of the p35S amplification were not statistically different, and all R2 values using DNeasy extracts were above 0.98 with no significant linear deviations. Two out of three R2 values using CTAB extracts were lower than 0.98, corresponding to lower degree of correlation, and the lack-of-fit test showed significant linear deviation in one run. The comparative analysis of the Ct values for the p35S and lectin targets demonstrated no statistical significant differences between the analytical curves of each target