Caracterização de gene de quitinase de Lutzomyia longipalpis: descrição de processamento alternativo e busca por seqüência promotora

Abstract

As leishmanioses são doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania transmitidos pela picada de flebotomíneos infectados. Os atuais métodos de combate a estas moléstias têm se mostrado ineficazes e maiores conhecimentos sobre a interação Leishmania-flebotomíneos são necessários para o desenvolvimento de novas formas de controle. Com o emprego da técnica de amostragem diferencial por RT-PCR (DDRT-PCR), foi encontrado anteriormente em nosso laboratório um cDNA codificante para uma quitinase intestino-específica de Lutzomyia longipalpis, nomeada LlChit1A. Foi visto que este produto do gene LlChit1 possui altos níveis de transcrição em fêmeas adultas 3 dias após a alimentação sangüínea, indicando um possível papel na degradação da matriz peritrófica (MP). Neste trabalho, um fragmento do LlChit1A foi usado para sondar uma biblioteca genômica de L. longipalpis, possibilitando o isolamento de um clone contendo o gene codificador desta enzima, que recebeu o nome LlChit1G. A amplificação por PCR e seqüenciamento deste gene revelaram a presença de 4 introns que interrompem a seqüência codificante para a LlChit1A. Foi visto por RT-PCR que o gene LlChit1 também está ativo em larvas, transcrevendo mais duas novas formas de splicing, nomeadas LlChit1B e LlChit1C. Estes dois novos transcritos possuem códons de parada, introduzidos a partir do quarto íntron, que interrompem a tradução do domínio de ligação à quitina codificado pelo último éxon. As possíveis novas enzimas codificadas devem atuar na digestão de alimentos ricos em quitina de maneira similar ao proposto para outras quitinases de inseto sem este domínio funcional. A região flanqueadora 5’ (RF5’) do clone genômico também foi amplificada por PCR e seqüenciada, evidenciando um possível promotor mínimo. Curiosamente, um gene ortólogo de Phlebotomus papatasi contém o começo da seqüência UTR 5` idêntica ao começo do RNAm da quitinase de L. longipalpis. Isso pode ser um indício de um possível sistema promotor conservado em flebotomíneos e com possível atuação na regulação da espessura da MP. Através da técnica de PCR invertido foi amplificada e seqüenciada uma região a montante do gene, não presente no LlChit1G. Análises de bioinformática indicaram a presença de um possível envolvimento de ecdisona no controle deste promotor. Através da anotação de ESTs codificantes para a seqüência completa ou parcial de proteínas similares a quitinases de L. longipalpis e P. papatasi foi possível identificar possíveis ortólogos de glicosideohidrolases da família 18. As seqüências primárias correspondentes ao domínio catalítilico encontrado nesta família foram comparadas por filogenia a seqüências já publicadas.Leishmaniasis is a disease caused by Leishmania protozoa transmitted by the bite of infected sand flies. Current methods used to combat this illness have been shown to be inefficient, and better knowledge of aspects related to Leishmania-sand fly interaction are necessary for the development of new controlling methods. A cDNA codifying for a midgut-specific chitinase of Lutzomyia longipalpis, nominated LlChit1A, was previously identified in our laboratory using differential display RT-PCR (DDRT-PCR). It was found that the LlChit1 gene had high transcription levels 3 days after blood meal, which indicated a putative role on peritrophic matrix (PM) degradation. A LlChit1A fragment, was used for screening a L. longipalpis genomic library, which led to the isolation of a clone called LlChit1G, containing the chitinase gene. The PCR amplification and sequencing of this gene revealed 4 introns which interrupt the LlChit1A cDNA sequence. RT-PCR showed that the LlChit1 gene is also expressed in larvae where it transcribed two new forms of splicing, called LlChit1B and LlChit1C. These two transcripts possess early stop codons in the last intron, interrupting the translation of the chitin binding domain (CBD) codified by the last exon. These putative enzymes possibly act in the digestion of chitin rich food, as previously observed for others insect chitinases without this functional domain. The flanking region 5’ (FR5’) present in the genomic clone was also sequenced, evidencing a possible minimum promoter. Curiously, the initial part of this 5’ UTR sequence was identical to the initial part of a Phlebotomus papatasi orthologous gene. This may be an indication of a promoter system conserved among sandflies, with possible performance in the control of PM thickness, which seems to occur exactly at the moment and place of Leishmania attachment to the epithelium of the midgut. The use of inverted PCR allowed the sequencing of a region upstream the chitinase gene, which is not present in the genomic clone. Bioinformatics analyzes suggested the participation of ecdysone on the expression control of this gene. The annotation for ESTs codifying complete and partial chitinase like proteins from L. longipalpis and P. papatasi provided the identification of 4 new genes from the first specie and 5 new genes from the later. These genes codify for protein conserved domains with high similarity to the catalytic domain of family 18 glycosylhydrolases. Phylogenetic trees were also constructed