Desenvolvimento da PCR em tempo real para amplifica????o do gene da Enzima M??lica (ME) em isolados de Giardia duodenalis

Abstract

Giardia duodenalis (G. duodenalis) ?? um protozo??rio ent??rico patog??nico distribu??do mundialmente e apresenta amplo espectro de hospedeiros mam??feros, incluindo humanos. Isolados deste parasito possuem grande diversidade gen??tica, apresentando sete gen??tipos (A-G) e diversos subtipos. No entanto, apenas os gen??tipos A e B infectam o homem e no subtipo A1 concentra-se o potencial zoon??tico do parasito. An??lise das sequ??ncias de amplicons de determinados marcadores moleculares demonstrou resultados discordantes na genotipagem de G. duodenalis evidenciando a necessidade de identificar novos marcadores. A proposta desse trabalho foi avaliar a aplicabilidade do locus da enzima m??lica (ME) comparando os resultados obtidos com o gene da ??-giardina (??g) usando a PCR convencional seguida de sequenciamento para detec????o e genotipagem de amostras cl??nicas. Foi desenvolvida uma PCR em Tempo Real - ME para detectar, quantificar e genotipar isolados de G. duodenalis diretamente de amostras de fezes. Foram usadas 100 amostras cl??nicas (83 humanas e 17 caninas) positivas segundo exame parasitol??gico e imunol??gico. A N - PCR convencional - ??g amplificou 61% destas (52 amostras humanas e sete caninas) e todas foram caracterizadas como gen??tipo A, sendo 42 subtipo A1 (38 humanas e quatro caninas) e 19 subtipo A2 (16 humanos e tr??s caninas). A N - PCR convencional - ME detectou apenas nove amostras (9%) positivas e todas pertencentes ao gen??tipo A, sendo seis humanas (quatro pertencentes ao subtipo A1, uma subtipo A2 e uma com subtipo indeterminado) e tr??s caninas (todas A1). Ao correlacionar a genotipagem por ambos marcadores, observou-se concord??ncia na identifica????o do gen??tipo. A compara????o do limite de detec????o da PCR convencional ME com a PCR em Tempo Real - ME demonstrou que esta ??ltima foi aproximadamente 10 4 vezes mais sens??vel. An??lise estat??stica dos resultados obtidos com as r??plicas da curva-padr??o indicou reprodutibilidade do m??todo e determinou que amostras negativas s??o aquelas com valores de Ct > 37. Desta forma, 71 amostras cl??nicas (71%) foram positivas na PCR em Tempo Real - ME com sonda para subtipo A1, destas 62 (87,3%) eram amostras humanas e nove (13,4%) caninas. A quantifica????o relativa de DNA de G. duodenalis nas amostras cl??nicas com a PCR em Tempo Real - ME, demonstrou que a concentra????o de cistos nas amostras analisadas variou de 4,21 ng a 204 fg (respectivamente, 22.000 e 1,0 cistos). A PCR em Tempo Real - ME apresentou maior sensibilidade em rela????o ?? N - PCR convencional - ME, indicando a necessidade de utiliza????o de novos iniciadores, pois os utilizados encontram-se em regi??es polim??rficas, como demonstrado pela an??lise das sequ??ncias de ME. Apesar da necessidade de mais estudos, os resultados obtidos neste trabalho indicam que a PCR em Tempo Real - ME possui potencial aplicabilidade nos estudos de epidemiologia molecular da giard??ase.Giardia duodenalis (G. duodenalis) is an intestinal protozoan parasite found worldwide in various mammalian hosts, including humans. G. duodenalis isolates display high genetic diversity with seven genotypes (A-G) and subtypes. However, only A and B assemblages have been detected in humans. The subtype A1 parasite presents the strongest zoonotic potential. Discordant genotyping and detection results of G. duodenalis isolates have been previously reported using amplicon sequence analysis from certain molecular markers. Therefore, this leads to the search of novel ones. The purpose of this work was to compare conventional PCR, followed by sequencing, using malic enzyme (ME) and ??-giardin gene (??g) as molecular markers for the detection and genotyping of the parasite found in faecal samples. Likewise, an approach involving Real Time PCR - ME for detecting, quantifying and genotyping G. duodenalis isolates was developed. We collected 100 positive faecal samples (83 humans and 17 canines) according to parasitological exam and immunoassays. N - PCR - ??g detected 61 positive samples (61%) from which 52 were human and seven were canine. All those samples were characterized as genotype A. Subtype A1 and A2 were determined in 42 (38 humans/4 canines) and 19 (16 humans/3 canines) samples, respectively. However N - PCR - ME analyses revealed that only nine faecal samples (9%) were positive (6 humans/3 canines) for genotype A. Six human samples were subtyped as A1 (4), A2 (1) and one not-determined, and the three canine samples were subtype A2. However, when correlating the sample genotyping using both markers, we have observed an agreement in the identification of the genotypes. The comparison of the detection limit between the N - PCR - ME and the Real Time PCR - ME showed that the latter one was approximately 104-fold more sensitive. The statistical analysis of the data from the standard curve replicates indicated reproducibility of the method. Furthermore, Ct values > 37 were established as an indicative for negative samples. Therefore, Real Time PCR - ME analysis revealed that 71 samples (71%) were positive for subtype A1 from which 62 (87.3%) and nine (13.4%) samples were humans and canines, respectively. The relative quantification of G. duodenalis DNA in the clinical samples using Real Time PCR - ME varied from 4.21 ng to 204.0 fg corresponding to 22.000 and one cyst, respectively. Overall, Real Time PCR ??? ME analysis showed to be more sensitive than N - PCR - ME. It, thus, suggest the need to design different primers, because the ones used were within a polymorphic region of the ME sequence. Although more investigation is yet to be done, the results achieved in this work indicate that Real Time PCR - ME has a great potential in the applicability for molecular epidemiological studies of giardiasis