Produção de lipases por Botryosphaeria ribis EC-01 em diferentes fontes de carbono

Abstract

Fungos do gênero Botryosphaeria são endofíticos e além de secretarem exopolissacarídeo e lacase, ainda não tinham sido descritos como produtores de lipase (E.C.3.1.1.3). Esta última enzima possui amplas aplicações biotecnológicas, podendo ser utilizada na produção de biodiesel, detergentes, medicamentos, processamento de cosméticos e também na indústria alimentícia. Neste trabalho foram avaliados nove isolados fúngicos do gênero Botryosphaeria, quanto à produção de lipases e lacases em diferentes óleos vegetais (soja, oliva, girassol, milho, canola, babaçu, gergelim e algodão) e também em glicerol, como fontes únicas de carbono. O Botryosphaeria rhodina MAMB-05 foi o isolado que se destacou como produtor de lacase, enquanto que o B. ribis EC-01 foi o melhor produtor de lipase, em todos os óleos vegetais e glicerol. O pH ótimo de atividade da lipase deste isolado foi 8,0 e a temperatura ótima 55ºC (2 minutos de reação); parâmetros que proporcionaram um aumento de 8 vezes na atividade enzimática. A solução de lipase do B. ribis EC-01 foi estável por 24 horas até 55 ºC e também foi na faixa de pH de 1,0 a 10,0 (75 % de atividade residual) por uma hora à temperatura ambiente (30 ± 2 ºC). A atividade da lipase foi aumentada na presença de 1,0 mM de K+, Zn2+, Na+, Ba2+ e Co2+, destacando-se Mn2+, Mg2+ e Ca2+ e os íons Cu2+ (1,0 mM) e Hg2+ (10 mM) diminuíram a atividade enzimática. Detergentes como Tween 80, SDS e Triton X-100 também aumentaram a atividade desta lipase. A enzima permaneceu praticamente 100 % estável na presença de 50 % (v/v) de metanol, etanol e glicerol e apresentou 68 % de atividade residual quando incubada em isooctano (99,3 %, v/v) durante 1 hora à temperatura ambiente. A lipase de B. ribis EC-01 é uma enzima constitutiva, não é regulada por glucose e sua produção nos diferentes carboidratos testados foi maior em lactose. Quando a fonte de carbono foi o óleo de soja (1,0 %, v/v), as fontes de nitrogênio e fosfato importantes para o aumento da atividade de lipase foram NH4NO3 e KH2PO4. A curva de crescimento revelou que a produção da enzima (U/mL) foi maior no 4º dia de cultivo, todavia, a melhor atividade específica foi registrada no 3º dia. O pH inicial do meio de cultivo beneficiou a produção da enzima quando acertado para 8,5, cujas atividades enzimática e específica foram 145,5 U/mL e 632,2 U/mg (120 h de cultivo), respectivamente. Dentre os detergentes avaliados como fonte de carbono, o Tween 80 (1,0 %, m/v) proporcionou maior produção de lipase pelo B. ribis EC-01 e quando as fontes de carbono foram diferentes ácidos graxos, o ácido esteárico emulsificado com Triton X-100 (0,1 %, m/v) foi a melhor fonte para a produção de lipase, seguido do ácido palmítico. A trioleína promoveu boa produção da enzima por este ascomiceto, enquanto que os triacilgliceróis tributirina e tricaprilina inibiram o crescimento do fungo. A lipase foi produzida em diferentes concentrações de glicerol, entretanto, a maior produção da enzima foi em 4,0 % (m/v). Através de planejamento estatístico de misturas e sendo estas representadas pelas fontes de carbono glicerol (futuro rejeito do biodiesel) e óleo de soja, foram realizados, para todas as Condições, delineamentos fatoriais fracionários (25-1). Os fatores selecionados foram: tempo de cultivo, pH inicial do meio, concentração de NH4NO3 (%, m/v), concentração de KH2PO4 (%, m/v) e velocidade de rotação (rpm). O tempo de cultivo e o pH inicial do meio foram as variáveis que mais influenciaram a produção de lipase pelo B. ribis EC-01 e uma mistura de glicerol e óleo de soja adequada foi 3,6 % (m/v) e 0,8 % (v/v), respectivamente. Para esta última Condição, no planejamento fatorial completo (25), maior produção de lipase (413,6 U/mg) foi obtida em 72 horas de cultivo a 120 rpm, com 0,4 % (m/v) de NH4NO3, 1,0 % (m/v) de KH2PO4 e pH inicial 4,5. Foi significante a interação entre todos os fatores, sendo o pH inicial do meio de cultivo a variável que mais influenciou a produção da lipase. A lipase de B. ribis EC-01 produzida em qualquer condição de cultivo hidrolisou ésteres de p-nitrofenila e triacilgliceróis de cadeia curta, média e longa. Somente as lipases obtidas dos cultivos que continham óleo de soja como uma das fontes de carbono e o pH inicial do meio era 5,8-6,0 (pH do meio de Vogel) ou 8,5 hidrolisaram o MUF-butirato (zimograma). O óleo de soja é produzido em abundancia no Brasil sendo um substrato barato para a produção de lipases, assim como o glicerol, que é um subproduto da indústria produtora de biodiesel. Portanto, o uso destas fontes de carbono pode ser uma estratégia biotecnológica viável para a obtenção de lipase por B. ribis EC-01.Fungi of the Botryosphaeria genus are endophytic and secrete exopolysaccharide and laccase, but have not been reported as lipase (E.C.3.1.1.3) producers. The latter enzyme has several biotechnological applications, and can be used in production of biodiesel, detergents, medicines, processing of cosmetics and in food industry as well. In this work, nine isolates of Botryosphaeria were evaluated for lipase and laccase production on different vegetable oils (soybean, olive, sunflower, maize, canola, babassu, sesame and cotton) and glycerol as sole carbon source. Botryosphaeria rhodina MAMB-05 was the best laccase producer, whereas B. ribis EC-01 produced lipase with the highest yields, in all vegetable oils and glycerol. Optimal pH for activity of the lipase produced by the latter was 8.0 and optimal temperature was 55 ºC (2-minute reaction time), and such parameters led to a 8-fold increase in enzyme activity. B. ribis EC-01 lipase solution was stable for 24 hours at up to 55 ºC and was likewise stable in pH ranging from 1.0 to 10.0 (75 % residual activity) for one hour at room temperature (30 ± 2 ºC). Lipase activity was increased in the presence of 1.0 mM K+, Zn2+, Na+, Ba2+ and Co2+, and was further increased in the presence of Mn2+, Mg2+ and Ca2+; on the other hand, Cu2+ (1.0 mM) and Hg2+ (10 mM) decreased enzyme activity. Detergents such as Tween 80, sodium dodecyl sulphate (SDS) and Triton X-100 also increased the activity of this lipase. This enzyme remained practically 100 % stable in the presence of 50 % (v/v) methanol, ethanol and glycerol, and had 68 % residual activity when incubated in isooctane (99.3 %, v/v) for 1 hour at room temperature (30°C ± 2 °C). The lipase from B. ribis EC-01 is a constitutive enzyme, it is not modulated by glucose, and it was produced in all carbohydrate carbon sources with highest yields on lactose. When soybean oil (1.0 %, v/v) was the carbon source, the important nitrogen and phosphate sources for increasing lipase production were NH4NO3 and KH2PO4. A growth profile showed the highest enzyme production (U/mL) in the fourth day of growth, however the best specific activity was observed in the third day. Initial pH of culture medium favoured enzyme production when adjusted to 8.5, leading to 145.5 U/mL and 632.2 U/mg (120 h growth time) of enzyme and specific activities, respectively. Amongst the detergents evaluated as carbon sources, Tween 80 (1.0 %, m/v) led to the highest production of lipase by B. ribis EC-01 and when different fatty acids were tested, stearic acid emulsified with Triton X-100 (0.1 %, m/v) was the best source for production of lipase, followed by palmitic acid. Triolein provided major production of enzyme by the same isolate, whereas triacylglycerols tributyrin and tricaprylin inhibited fungal growth. Lipase was produced on all glycerol concentrations with the highest yields on 4.0 % (m/v). Statistical planning of mixtures containing the carbon sources glycerol (biodiesel byproduct) and soybean oil were carried out for all conditions, using fractional factorial designs (25-1). Selected factors were: growth time, initial medium pH, NH4NO3 (w/v), KH2PO4 (w/v) and rotation speed (rpm). Growth time and initial medium pH were the most influential variables in production of lipase by B. ribis EC-01 and the adequate mixture of glycerol and soybean oil contained 3,6 % (w/v) and 0.8 % (v/v) respectively. For the latter condition, in the full factorial design (25) the highest yield of lipase (413.6 U/mg) was observed in 72 hours of growth at 120 rpm, with 0.4 % (w/v) NH4NO3, 1.0 % (w/v) KH2PO4 and initial pH 4.5. Interactions amongst all factors were significant, and initial pH of culture medium was the variable that most markedly influenced production of lipase. The B. ribis EC-01 lipase was produced in any culture conditions and hydrolysed p-nitrophenyl esters and triacylglycerols of short-, medium- and long-chain. Only the lipases obtained from cultures containing soybean oil as one of the carbon sources, and initial pH of either 5.8-6.0 (Vogel’s medium pH) or 8.5 hydrolysed MUF-butyrate (zymogram). Soybean oil is abundantly produced in Brazil, and along with glycerol, a byproduct from production of biodiesel, can be used as a low-cost substrate for production of lipases. Therefore, the use of these carbon sources can be a feasible biotechnological strategy for obtaining lipase B. ribis EC-01