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Expression of microRNA-22 down-regulates protein levels of ErbB3 in human lung adenocarcinoma

By 謝玉玲 and Yu-Ling Hsieh

Abstract

受體ErbB蛋白是屬於細胞表面受體中酪胺酸激酶的一員,若ErbB受體被不正常的活化,使細胞內訊息傳遞失去正常調控,會造成細胞過度生長、抑制細胞凋亡、增加血管新生、增加腫瘤的侵犯與轉移能力。最近的研究表明,有些癌症逃避ErbB1或ErbB2的標靶治療,藉著持續激活ErbB3-PI3K-Akt的途徑。ErbB3有潛力成為治療癌症的標靶,本實驗用老鼠產生了對ErbB3受體膜內酪胺酸激酶區的多株抗體,這有助於未來對於癌症治療的研究。 偵測ErbB3 mRNA於肺癌和乳癌細胞株之表現,結果顯示ErbB3 mRNA於各肺癌和乳癌細胞株都有表現,之後以西方墨點法和自行製造之ErbB3多株抗體,分析ErbB3蛋白於肺癌和乳癌細胞株的表現情形,結果發現ErbB3蛋白在各乳癌細胞株都有表現,但在各肺癌細胞株中ErbB3蛋白的表現量甚少,有的肺癌細胞株幾乎沒有表現。利用線上資料庫尋找可能調控ErbB3的microRNA,結果發現 microRNA-22(mir-22)最具有潛力。我們利用ErbB3 RNAi(shRNA)抑制了MCF-7乳癌細胞的ErbB3蛋白表現,結果顯示ErbB3是癌細胞生長所必需的。當我們加miRNA-22到乳癌細胞時,miRNA-22會抑制ErbB3在乳癌細胞中的表現;另一方面,我們加miRNA-22抑製劑到肺癌細胞,miRNA-22抑製劑會增加ErbB3在的肺癌細胞中的表現。利用原位雜交技術,我們更進一步發現miRNA-22存在肺癌病人的組織切片。我們的數據顯示在肺腺癌細胞中,雖然ErbB3 mRNA表現的很頻繁,但是ErbB3蛋白的表現卻不是如此;在肺癌細胞中造成ErbB3轉錄和轉譯之間的差異,可能是由於microRNA-22下調ErbB3蛋白表現。ErbB receptor is a member of receptor tyrosine kinase ( RTK ) in the cell surface. If ErbB is abnormally activated, it induces cell growth, inhibits cell death, increases angiogenesis and tumor ability to invasion and metastasis. In recent studies, cancers which escape target therapy of ErbB1 or ErbB2 are persistently activated by ErbB3-PI3K-Akt pathway. ErbB3 is becoming a potential target of remedying cancer. In this study, we produced antibodies to ErbB3 to study the function of ErbB3. Monitoring ErbB3 mRNA in lung and breast cancer cells, we found that ErbB3 mRNA was abundantly expressed in these cancer cells. Using Western blotting, and home-made antibodies to ErbB3, we found that although ErbB3 protein was highly expressed in breast cancer cells, it was rarely expressed in lung cancer cells. We used a web program to search for microRNA, which could be associated with ErbB3 expression, and we found miRNA 22 ( miR-22)could be potential candidate. We tested first using ErbB3 RNAi(shRNA)to suppress ErbB3 expression in MCF-7 breast cancer cells display, and the results showed that ErbB3 was essential for cancer cell growth. When we added miRNA-22 to the breast cancer cells, it inhibited ErbB3 expression as well. Addition of inhibitors to miRNA22, on the other hand, increased ErbB3 expression in lung cancer cells. Using in situ hybridization, we further identified miRNA 22 in lung cancer specimens. Our data showed that although ErbB3 mRNA was frequently detected in lung adenocarcinoma, the protein products were not. Discrepancies between transcription and translation of ErbB3 could be caused by the presence of microRNA-22 to down-regulate ErbB3 protein expression in lung cancer cells.摘要 I Abstract II 目次 III 第一章、緒論 1 一、肺癌 1 (一)肺癌的分類 1 (二)肺癌的各類分期 2 (三)肺癌的相關成因及臨床特徵 2 (四)肺癌的發病機制 4 (五)肺癌的治療 5 二、乳癌 5 (一)乳癌的分類 6 (二)乳癌的成因 6 (三)乳癌的高危險因子 7 (四)乳癌的治療 8 三、表皮生長因子受體家族(epidermal growth factor receptor family) 9 四、人類表皮生長因子受體第三型(human epidermal growth factor receptor 3, ErbB3) 12 第二章、材料與方法 16 一、材料 16 (一)、細胞株(cell lines) 16 (二)、肺癌病人組織切片 16 (三)、引子(primer)設計 16 (四)、質體 (plasmid) 16 (五)、勝任細胞(competent cell) 16 (六)、干擾性核醣核酸(RNAi, RNA interference) 17 (七)、microRNA-22的引子、接合引子(adapter primer)與探針 17 (八)、藥品(附錄三) 17 (九)、緩衝溶液(附錄四) 17 (十)、抗體(表八) 17 (十一)儀器 17 二、方法 18 (一)、增幅目標基因片段 18 1、聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR) 18 2、瓊脂膠體電泳(agarose gel electrophoresis) 18 3、切膠回收(clean up) 18 (二)、放大DNA序列的載體(pCRII-TOPO vector)與TA cloning 19 1、ErbB3與pCRII-TOPO vector之接合(ligation) 19 2、帶有ErbB3的pCRII-TOPO vector之轉形作用(transformation) 19 3、酵素確認(enzyme digestion) 20 (三)、重組蛋白表現的載體(pET32a vector) 20 1、製作插入pET32a vector的ErbB3 plasmid 20 2、抽取pET32a質體(plasmid) 21 3、限制酵素切割(restriction enzyme cutting) 21 4、增幅的基因片段(ErbB3)與pET32a vector之接合(T4 DNA ligase ligation) 21 5、帶有ErbB3的pET32a vector之轉形作用(transformation) 22 6、酵素確認(enzyme digestion) 22 (四)、重組蛋白之表現 22 1、轉形作用(transformation) 22 2、小量製備重組蛋白 23 3、大量製備重組蛋白 24 (五)、多株抗體的製備(polyclonal antibody production) 26 1、小鼠免疫反應(immunizing mouse) 26 2、酵素結合免疫吸附反應(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 27 (六)、西方墨點法(Western blot) 28 1、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 28 2、蛋白質電泳及轉印(transfer) 28 3、免疫反應與顯色 29 (七)、細胞培養(cell culture) 29 1、細胞解凍 29 2、細胞繼代(sub-culture) 30 3、細胞計數(cell counting) 30 (八)、干擾型RNA(RNAi)進行基因減弱(gene knockdown) 30 1、shRNA(short hairpin)進行基因減弱 30 2、miRNA(microRNA)進行基因減弱 32 (九)、反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 33 1、RNA的萃取(total RNA extraction) 33 2、在RNA的尾端加A(polyadenylation) 33 3、反轉錄作用(reverse transcription, RT) 34 4、聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR) 34 (十)、原位雜交(in stiu hybridization, ISH) 35 第三章、結果 36 一、ErbB3在肺癌和乳癌細胞株mRNA的表現情形 36 二、ErbB3重組蛋白的構築 36 三、ErbB3重組蛋白的表現 37 四、ErbB3重組蛋白的大量表現與純化 37 五、ErbB3重組蛋白“pET32a(+)-ErbB3”蛋白質身份鑑定 38 六、多株抗體的製備 39 七、ErbB3蛋白於肺癌和乳癌細胞株的表現情形 39 八、軟體預測可能調控ErbB3的miRNA 39 九、使用干擾型RNA(shRNA)進行ErbB3 knockdown 40 十、使用干擾型RNA(microRNA-22, mir-22)進行ErbB3 knockdown 40 十一、microRNA-22(mir-22)於肺癌細胞株的表現情形 41 十二、microRNA-22(mir-22)於肺癌病人組織切片的表現情形 41 十三、ErbB3蛋白於小鼠器官的表現情形 42 第四章、討論 43 第五章、結論與展望 48 第六章、表 49 一、細胞株 49 二、引子對 50 三、探針 50 四、接合引子(adapter primer) 51 五、RNA干擾序列 52 六、預測miRNA(microRNA)之網站 53 七、線上資料庫預測可能調控ErbB3之miRNA(microRNA) 53 八、抗體 54 第七章、圖 55 一、ErbB3在9株肺癌細胞株及5株乳癌細胞株mRNA的表現情形 55 二、ErbB3蛋白親疏水性分析 56 三、重組質體pCRII-ErbB3之構築 56 四、重組質體pET32a(+)-ErbB3之構築 57 五、ErbB3重組蛋白表現(0和3小時) 58 六、ErbB3重組蛋白表現(0~5小時) 59 七、ErbB3重組蛋白之純化 60 八、以MALDI-TOF確認ErbB3重組蛋白身分及ErbB3重組蛋白序列比對 61 九、ErbB3多株抗體之製備 62 十、ErbB3蛋白於肺癌和乳癌細胞株中的表現情形 63 十一、干擾型RNA (shRNA)進行ErbB3 knockdown 64 十二、干擾型RNA (miRNA)進行ErbB3 knockdown 64 十三、microRNA-22在肺癌細胞株中的表現情形 65 十四、肺癌細胞中microRNA-22之定序結果 65 十五、microRNA-22在肺癌病人組織切片的表現情形 66 十六、ErbB3蛋白於小鼠各器官內的表現情形 66 第八章、參考文獻 67 附錄 7

Topics: 受體ErbB3, 酪胺酸激酶肺腺癌, microRNA-22, ErbB3, lung adenocarcinoma
Publisher: 生命科學院碩士在職專班
Year: 2014
OAI identifier: oai:ir.lib.nchu.edu.tw:11455/81132
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