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Structural and Biochemical studies of the Toll-like receptor TIR domain and adaptor protein TIR domain interaction

By 蕭文鵑 and Wen-Chuan Hsaio

Abstract

先天免疫為人體的免疫系統中抵抗病原菌入侵的第一道防線。偵測病原菌的受體主要表現在吞噬細胞、樹突狀細胞(dendritic cells)、淋巴細胞、表皮細胞、內皮細胞等。這些受體分佈在細胞表面,或分佈在細胞質中作為病原菌感染的感應器。當外來病原入侵人體時,Toll-like receptor (TLRs) 辨識結合不同的病原相關分子模式 (Pathogen-associated molecular patterns ,PAMPs) ,啟動先天免疫系統,將訊息往下傳遞,阻止感染擴大。目前,已知的TLRs共有10種,分別從TLR1到TLR10。某些TLR結構也已經確定,而TLR的TIR domain 與 adapter protein TIR domain之間的同源或異源嵌合分子機制,至今仍不清楚,亦沒有任何同源或異源嵌合複合物的結構被觀察到。 本研究中,我們利用大腸桿菌的表現系統來表現TIR domain之片段,將這些蛋白基因構築在不同的載體,嘗試大量表達這些蛋白,以觀察蛋白質之間交互作用及是否有形成複合物,我們大規模地重組篩選TLR家族及Interleukin 1 Receptor與不同的下游蛋白質 (如:TIRAP、MyD88) TIR-TIR domain形成的複合物來研究調控免疫反應之可能性,一共包含了TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TIRAP、MyD88、IL1RL、IL1RAP等14種蛋白。我們將獲得的蛋白質利用親和層析法區分單體或複合物,接著純化濃縮後進行結晶條件的篩選。另外,我們將蛋白質濃縮為不同濃度後,進行小角度X光散射實驗 (small-angle X-ray scattering),並配合電腦軟體來構築出蛋白質於溶液中的結構。 目前我們有明顯觀察到TLR 與 adapter protein TIR-TIR domain之間異源嵌合分子交互作用,未來將進一步探討蛋白質結晶結構及利用點突變試驗確認交互作用位置。目錄 摘要 i Abstract ii 表次 v 圖次 vi 第一章 前言 1 1-1 探討Toll like receptors (TLRs) TIR複合物形成之可能性 1 1-2 以小角度X光散射技術研究蛋白質結構 2 第二章 材料與方法 5 2-1、實驗儀器與設備 5 2-3、實驗方法 8 2-3-1、TIR結構域基因序列排序與選殖 8 2-3-2、引子之設計 8 2-3-3、聚合酶連鎖反應 (PCR, polymerase chain reaction) 8 2-3-4、膠體電泳 9 2-3-5、Restriction enzyme Digestion 9 2-3-6、Ligation 9 2-3-7、E.coli 勝任細胞之製備 10 2-3-8、轉殖作用 (Transformation) 10 2-3-9、Colony PCR 10 2-3-10、蛋白質表現載體構築 11 2-3-11、SDS-PAGE 11 2-3-12、TIR結構域複合體的表現與純化 12 2-3-13、蛋白質結晶測試 (Crystallization Test) 13 2-3-14、小角度X光散射實驗 (Small Angle X-Ray Scattering, SAXS) 14 2-3-15、點突變實驗 15 第三章 結果 16 3-1、目標蛋白TIR結構域基因序列選殖 16 3-2、TLRs蛋白質表現載體構築 16 3-3、表達測試以尋找TIR結構域複合體的表達條件 16 3-3-1、小量蛋白質表達之最佳誘發溫度 16 3-3-2、蛋白質表達之不同誘導時機比較 17 3-3-3、小量蛋白質之不同IPTG誘導濃度比較 17 3-4、TLRs基因預測結果與功能分析 18 3-4-1、TLRs大量表現以及純化 18 3-4-2、TLRs結晶條件篩選 19 3-5、小角度X光散射實驗及數據分析 20 3-6、點突變尋找TIR結構域複合體接合位置 20 第四章 討論 22 4-1、基因選殖與表達測試 22 4-2、TLR4, TLR8, TLR9 的表達 23 4-3、TLR2 pull-down 實驗與複合體的形成 23 4-4. TIR 結構域複合體的組成 24 4-4-1、H-TLR2+H-TLR1+TIRAP-H+MyD88-H 複合體 24 4-4-2、H-TLR2+MyD88-H 複合體 24 4-5、TIR 結構域複合體的小角度X光散射實驗 25 4-6、點突變分析實驗 26 4-7、分析問題與現狀改進 26 第五章 總結 27 第六章 參考文獻 28 附表 31 附圖 35 附錄 6

Topics: 多聚體, complexs
Publisher: 生命科學院碩士在職專班
Year: 2014
OAI identifier: oai:ir.lib.nchu.edu.tw:11455/81125
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