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Purification et séparation concomitantes de la propancréatopepridase D et d'un nouveau chymotrypsinogène à partir du pancréas de porc

By Jean-Claude Moreux

Abstract

Dans ce travail on décrit une nouvelle méthode chromatographique permettant la séparation simultanée de deux précurseurs enzymatiques à activité proélastinolytique. Le matériel de départ utilisé est une préparation de pancréas de porc. La séparation est effectuée à pH acide, en présence de tampon acétate, en utilisant une poudre cristalline d'hydroxyapatite comme phase stationnaire. La phase mobile est constituée par un tampon acétate (pH 4.5) dont la molarité croît de façon linéaire en fonction de l'élution des produits adsorbés sur la colonne. Cette méthode est parfaitement reproductible. De façon typique on obtient par ordre d'élution: 1) un zymogène présentant une double activité propeptidasique vis-a-vis de l'élastine et proestérasique pour l'ATEE ce zymogène a été appelé successivement proélastase B, puis, après identification ultérieure, chymotrypsinogène D; 2) un second zymogène présentant seulement l'activité proélastinolytique ce zymogène a été appelé successivement proélastase A, puis après identification ultérieure, propancréatopeptidase E; 3) enfin, un dernier zymogène développant seulement une activité proestérasique pour l'ATEE seulement; sans avoir fait une identification parfaite de ce zimogène, il est possible d'affirmer qu'il s'agît de chymotrypsinogène A vraisemblablement. Les trois produits ainsi obtenus sont homogènes par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, les deux premiers à pH acide et à pH alcalin. Le chymotrypsinogène D et la propancréatopeptidase E sont des protéines cationiques et monocaténaires dont les poids moléculaires sont pratiquement identiques. Dans les deux cas les valeurs obtenues sont comprises entre 27 et 28,000. Ces valeurs ont été mesurées par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium et par équilibre de sédimentation en ultracentrifugation. L'analyse du contenu en aminoacides de ces deux zymogènes montre, pour la propancréatopeptidase E une composition sensiblement identique à celle de la pancréatopeptidase de porc, et pour la chymotrypsinogène D une composition très proche de celle des chymotrypsinogènes B et C de porc. La séquence aminoterminale des trente premiers résidus de la chaîne polypeptidique de chacune de ces protéines a été effectuée au laboratoire grâce à la collaboration du Dr. D. GIBSOK. Cette détermination révèle la séquence des deux peptides d'activations : - celui de la propancréatopeptidase E comporte dix résidus, le dernier étant un résidu arginyle; les 20 autres résidus identifiés sont bien ceux de la pancréatopeptidase E de porc confirmant bien ainsi l'identification préalable; - celui du chymotrypsinogène D est nouveau et contient 15 résidus présentant un degré d'homologie important avec les autres peptides d'activation des différents chymotrypsinogènes de boeuf et de porc; les 15 autres résidus de notre séquence suivent pratiquement la séquence de la chymotrypsine B de boeuf. Ces zymogènes sont activables par la trypsine et l'action du DFP provoque une inactivation irréversible des produits d'activation. La pancréatopeptidase E obtenue par activation de son zymogène hydrolyse parfaitement l'ATAME, alors que la chymotrypsine D en est absolument incapable. Cependant ces deux enzymes peuvent solubiliser complètement une suspension d'élastine à la température ordinaire, à pH 8.6 en tampon borate. Une étude cinétique de l'élastinolyse par la pancréatopeptidase E et le chymotrypsinogène D montre que, si les deux enzymes hydrolysent ce substrat avec une vitesse maximale identique, les valeurs de la constante de MICHAELIS diffèrent par un facteur de 10, la valeur la plus élevée étant celle de la chymotrypsine D. Comme la pancréatopeptidase E, la chymotrypsine D hydrolyse synergiquement l'élastine en présence d'une autre endopeptidase comme la trypsine ou bien la pancréatopeptidase E. La pancréatopeptidase E étant déjà bien connue, cette méthode de préparation valable aussi pour le chymotrypsinogène D peut permettre l'étude des propriétés catalytiques uniques jusqu'à présent d'un des enzymes de la famille des chymotrypsines

Publisher: Université de Sherbrooke
OAI identifier: oai:savoirs.usherbrooke.ca:11143/14720
Provided by: Knowledge UdeS
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