Đánh giá khả năng tăng cường tích lũy tinh bột ở cây thuốc lá chuyển gen AGPS và AGPL mã hóa Enzyme AGPase ở cây sắn

Abstract

The AGPase (ADP-Glucose pyrophosphorylase) is one of the ubiquitous enzymes catalyzing the first step in starch biosynthesis. It plays an important role in regulation and adjusts the speed of the entire cycle of glycogen biosynthesis in bacteria and starch in plants. In higher plants, it is a heterotetramer and tetrameric enzyme consisting two large subunits (AGPL) and two small subunits (AGPS) and encoded by two genes. In this paper, both AGPS and AGPL genes were sucessfully isolated from cassava varieties KM140 and deposited in Genbank with accession numbers KU243124 (AGPS) and KU243122 (AGPL), these two genes were fused with P2a and inserted into plant expression vector pBI121 under the control of 35S promoter. The efficient of this construct was tested in transgenic N. tabacum. The presence and expression of AGPS and AGPL in transgenic plants were confirmed by PCR and Western hybridization. The starch content was quantified by the Anthrone method. Transgenic plant analysis indicated that that two targeted genes were expressed simultaneously in several transgenic tobacco lines under the control of CaMV 35S promoter.  The starch contents in 4 analyzed tobacco transgenic lines displays the increase 13-116%  compared to WT plants. These results indicated that the co-expression of AGPS and AGPL is one of effective strategies for enhanced starch production in plant. These results can provide a foundation for developing other genetically modified crops to increase starch accumulation capacity.Enzyme AGPase là một trong những enzyme quan trọng, xúc tác cho bước đầu tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột và đã được chứng minh là enzyme điều hòa, điều chỉnh tốc độ phản ứng của toàn bộ chu trình sinh tổng hợp glycogen ở vi khuẩn và tinh bột ở thực vật. Ở thực vật bậc cao, AGPase được xác định là enzyme dị lập thể, được cấu tạo bởi hai tiểu phần lớn (AGPL) và hai tiểu phần nhỏ (AGPS) do hai gen tương tứng mã hóa. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập hai gen mã hóa cho tiểu phần lớn và tiểu phần nhỏ của AGPase từ giống sắn KM140. Hai gen được nối với nhau bằng trình tự P2a và được biểu hiện đồng thời trên một khung đọc mở dưới sự điều khiển của promoter CaMV 35S. Cấu trúc này được chèn vào vector pBI121 và được biến nạp vào cây thuốc lá bằng phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens. Cây chuyển gen được kiểm tra bằng phương pháp PCR, Western blot và định lượng hàm lượng tinh bột bằng phương pháp Anthrone. Kết quả đã cho thấy hàm lượng tinh bột tích lũy trong lá cây chuyển gen cao hơn các cây đối chứng từ 13-116% trong cùng điều kiện nuôi dưỡng. Nghiên cứu của chúng tôi tạo ra thêm một hướng tiếp cận trong việc tạo cây trồng biến đổi gen tăng cường khả năng tích lũy tinh bột