Valutazione dell’efficienza di espressione di diverse varietà di Nicotiana tabacum per l’utilizzo nel Molecular Farming come produttrici di molecole ricombinanti ad azione terapeutica.

Abstract

Nel campo dell’ingegneria genetica, negli ultimi decenni, si è andato sempre più affermando il concetto della pianta come 'biofabbrica' per la produzione di numerose molecole complesse di origine diversa (Plant Molecular Farming). Inoltre, in ambito medico/terapeutico molte delle attuali ricerche biotecnologiche sono dirette allo sviluppo di nuovi farmaci e si focalizzano prevalentemente su quelli di natura proteica, mentre le molecole ricombinanti attualmente in uso, vengono principalmente prodotte utilizzando batteri, funghi o colture di cellule animali. Tramite microrganismi e lieviti, però, si possono produrre solo sostanze di ridotta complessità in quanto molte delle modificazioni post-traduzionali che sono necessarie affinché le proteine raggiungano la forma matura e, quindi, attiva, avvengono esclusivamente in cellule di eucarioti superiori. La produzione di sostanze ad uso farmaceutico tramite colture cellulari animali, invece, è associata al rischio di contaminazione da parte di patogeni dannosi alla salute umana come il virus dell’AIDS e delle epatiti, la BSE e le sostanze carcinogeniche. Questi stessi problemi si hanno quando, come biofabbriche vengono utilizzati gli animali. La distanza genetica esistente tra le piante e l’uomo rappresenta, quindi, un grosso vantaggio nella produzione di proteine terapeutiche tramite Molecular Farming in quanto si riducono fortemente i rischi legati al trasporto di patogeni dannosi alla salute umana, è possibile produrre e configurare correttamente anche proteine complesse e, inoltre, i processi di estrazione risultano semplificati poiché, nei vegetali, non esistono proteine farmacologicamente attive simili a quelle umane. Il maggiore vantaggio risiede, tuttavia, nei costi di produzione che sono estremamente più ridotti rispetto a quelli che contraddistinguono le attuali tecniche di produzione di proteine ricombinanti. Il tabacco, a livello di letteratura, ha una lunga storia come coltura di successo per la Molecular Farming ed è, quindi, uno dei candidati principali per la produzione commerciale di questa tipologia di farmaci. L’obiettivo della seguente tesi, quindi, era è quello di valutare la capacità di espressione di un gene marcatore in due varietà di Nicotiana tabacum tra le più produttive in termini di biomassa vegetale, in virtù del loro possibile impiego in qualità di biofabbriche per la produzione di molecole ricombinanti ad azione terapeutica. Il lavoro sperimentale è consistito nella valutazione di tipo qualitativo dell’espressione di un gene marcatore nelle varietà Kentucky e Maryland Mammoth, poste a confronto con il tabacco Petit Havana SR1, una tra le piante che sono state maggiormente utilizzate in campo sperimentale per tale scopo, ma che risulta caratterizzata da una ridotta capacità produttiva. Come gene marcatore è stata utilizzata una β-glucoronidasi, la cui proteina espressa dopo infiltrazione di un apposito buffer nel materiale vegetale e decolorazione con alcool etilico dà al tessuto una colorazione blu. La trasformazione è stata effettuata su espianti fogliari tramite Agrobacterium tumefaciens; le sezioni hanno prodotto callo e successivamente shoots che sono stati poi coltivati come singole linee sulle quali è stato effettuato il saggio GUS per verificare l’espressione. Sono state selezionate alcune linee positive delle varietà in esame e sono state portate a seme per valutare il mantenimento del gene e l’eventuale segregazione su mezzo selettivo della generazione F1. Le linee di Kentucky, essendo maschiosterili, sono state impollinate con una linea positiva di Maryland Mammoth. I risultati hanno evidenziato un alto livello di rigenerazione degli espianti, dopo la trasformazione, nelle varietà prese in esame, del tutto comparabili con quelli ottenuti dal testimone SR1. L’espressione del gene GUS, di contro, nelle varietà Kentucky e Mammoth è risultata inferiore, in termini percentuali, rispetto a quella ottenuta dal controllo ma, comunque, i valori raggiunti sono da considerarsi soddisfacenti ai fini di un loro possibile impiego nel Molecular Farming (previa valutazione quantitativa della proteina espressa). Tutte le linee, coltivate in ambiente controllato, hanno prodotto semi fertili. Valutata la segregazione dei semi F1 su mezzo selettivo, è stato effettuato un saggio GUS per diverse linee delle varietà Kentucky ed SR1 ottenute dai semi F1; tutti i campioni sono risultati positivi al saggio. Sono in corso test per la valutazione dell’espressione del gene marcatore in piante F1 di Maryland Mammoth. Alla luce di questi primi risultati, quindi, le varietà in prova possono essere considerate come valide candidate al loro utilizzo nella Molecular Farming, per la produzione di molecole ricombinanti ad azione terapeutica