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Vergleichende Untersuchungen zur Serumempfindlichkeit von Borrelia lusitaniae

By Roswitha Dieterich

Abstract

Borrelia lusitaniae, eine vorwiegend im Mittelmeerraum/ Südwesteuropa vorkommende Borrelienspezies des B. burgdorferi s.l.-Komplexes, wird derzeit als eine potentiell humanpathogene Genospezies diskutiert. Für vergleichende Studien stehen derzeit vorwiegend Zeckenisolate und nur zwei Patientenisolate zur Verfügung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden insgesamt 16 Isolate, darunter ein Patientenisolat aus verschiedenen Regionen Portugals und Süddeutschlands im Bezug auf ihre Serumempfindlichkeit/-resistenz gegenüber humanem Serum und der Fähigkeit Komplementregulatoren aus Serum zu binden, untersucht. Anhand der erhaltenen Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass B. lusitaniae, mit Ausnahme des Stammes IP-N1, als serumsensible Genospezies klassifiziert werden kann. Alle Isolate aktivierten die Komplementkaskade hauptsächlich über den alternativen Weg wobei massiv Komplementkomponenten auf der Zelloberfläche deponiert wurden. Die effiziente Aktivierung und Ablagerung des terminalen Komplementkomplexes führte zur vermehrten Ausbildung sogenannter Blebs, Ausstülpungen der äußeren Membran, was auf eine effiziente Lyse der Borrelienzellen hinwies. Obwohl serumsensibel, waren alle Isolate in der Lage, den löslichen Komplementregulator des alternativen Weges, Faktor H aus dem Serum zu binden. Allerdings konnte nur bei 4 der 16 untersuchten Isolate eine schwache komplementregulatorische Aktivität von zellgebundenem Faktor H durch den Nachweis spezifischer C3b-Spaltprodukte bestätigt werden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Faktor H in seiner Eigenschaft als Komplementregulator inhibiert ist. Durch weiterführende Analysen konnte ein Faktor H-bindendes Protein von 16 kD bei B. lusitaniae MT-M8 identifiziert und charakterisiert werden. Dieses als BlCRASP-3 bezeichnete Protein war in der Lage, Faktor H über dessen C-terminale SCR-Domänen 19-20 zu binden. Im Vergleich zu anderen mit Faktor H interagierenden Proteinen war die Bindung sehr schwach und erreichte nur ca. 16% der Bindungsstärke von BbCRASP-3, was eine nicht nachweisbare Kofaktoraktivität von an BlCRASP-3 gebundenem Faktor H erklären könnte. Sequenzanalysen und Untersuchungen mit verschiedenen Proteasen identifizierten BlCRASP-3 als ein auf der Oberfläche von B. lusitaniae lokalisiertes Lipoprotein, welches eindeutig zur heterologen Erp-Proteinfamilie gehört. Interessanterweise ist bei BlCRASP-3 jener Bereich am C-Terminus konserviert, der als Faktor H-Bindungsstelle erachtet wird. Die nicht konservierten Austausche einzelner Aminosäuren innerhalb der vermuteten Bindungsregion und das Fehlen höher geordneter Strukturen, wie z.B. coiled-coils, könnten die stark reduzierte Bindungskapazität von Faktor H an BlCRASP-3 erklären. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die schwache Bindung von Faktor H und die Inhibition der komplementregulatorischen Aktivität von Faktor H, als Ursachen für den fehlenden Schutz vor der durch Komplement vermittelten Lyse angenommen werden kann, wodurch die untersuchten B. lusitaniae-Isolate einen serumsensiblen Phänotyp aufweisen. Des Weiteren konnten bei allen untersuchten B. lusitaniae Isolaten erp-homologe Gensequenzen auf Plasmiden unterschiedlicher Größe nachgewiesen werden. Manche Isolate wiesen multiple erp-Loci auf. Durch PCR konnten erp-homologe Gensequenzen amplifiziert werden, die für ErpL/ErpY-orthologe Proteine kodieren und nicht mit Faktor H interagieren. Welche Funktion diese Proteine für Borrelien besitzen bleibt weiterhin ungeklärt. Es ist denkbar, dass diese Proteine bei der Erregerpersistenz oder dem Immunescape in der Eidechse als natürlichem Wirt eine wichtigen Rolle spielen oder Borrelien ermöglichen, sich an andere Reservoirwirte anzupassen.Borrelia lusitaniae delineated as a novel genospecies of the B. burgdorferi sensu lato complex is predominantly found in ticks collected from the Mediterranean region in the southwest of Europe. It is still unclear, whether this genospecies causes Lyme disease in humans. Mainly isolates obtained from ticks are available for comparative studies and there are only two isolates obtained from Lyme disease patients. In this study 16 isolates of different regions of Portugal and southern Germany, including a human isolate, were characterised in regard to their ability to resist complement-mediated killing in human serum and their ability to acquire human regulators of complement. The results of this study show that B. lusitaniae, except isolate IP-N1, is a serum sensitive genospecies. All isolates activated complement predominantly via the alternative pathway which in turn resulted in the deposition of huge amounts of activated complement components on the outer cell surface. Activation and accumulation of the membrane attack complex led to the formation of so-called blebs, drastical morphological changes and protuberances of the outer membrane. This phenomenon clearly indicates efficient lysis of the spirochetes. Though B. lusitaniae was characterised as a serum sensitive genospecies, all isolates analysed bound factor H, a soluble complement regulator of the alternative pathway from human serum. Via detection of specific cleavage products of C3b, a weak complement regulatory activity of cell bound factor H could only be demonstrated for 4 out of 16 isolates. Further analysis identified and characterised a factor H binding protein with a molecular mass of 16 kDa of the B. lusitaniae isolate MT-M8. This protein, BlCRASP-3, was able to bind factor H via the C-terminal SCR domains 19 to 20. In comparison to other factor H binding CRASP proteins the interaction of BlCRASP-3 with factor H appeared to be rather weak and represents only 16 % of the binding intensity of the B. burgdorferi BbCRASP-3 protein. The weak binding capacity of BlCRASP-3 might be the reason for a barely measurable regulatory activity of cell-bound factor H in some isolates. Sequence analysis and protease assays identified BlCRASP-3 as a surface exposed lipoprotein belonging to the polymorphic Erp protein family. Interestingly, the C-terminus considered to be essential for factor H binding, is highly conserved in the BlCRASP-3 protein. It is suggested that the non-conserved substitution of individual amino acids in the proposed binding region and the absence of higher order structures such as coiled-coil may convert BlCRASP-3 to a factor H binding molecule exhibiting reduced binding properties. In summary the weak binding capability of factor H accompanied with the inhibition of its complement regulatory activity may result in a loss of protection of B. lusitaniae from complement-mediated lysis and therefore may explain the serum sensitive phenotype. In addition all B. lusitaniae isolates analysed contain erp-homologous sequences on various plasmids whereby particular isolates also show multiple erp loci. Furthermore, erphomologous sequences encoding for diverse ErpL/ErpY-orthologous proteins could be amplified by PCR. The function of these non-factor H binding proteins in this genospecies is still unclear. It is tempting to speculate that these molecules play a role in immune escape of B. lusitaniae during persisting infection of lizards or allow the pathogen to adapt to different reservoir hosts

Topics: ddc:610
Year: 2011
OAI identifier: oai:publikationen.ub.uni-frankfurt.de:20669

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