Imunossensor microfluídico para quantificação de cortisol salivar

Abstract

Tese de doutoramento em Engenharia BiomédicaO stress físico e psicológico resultante do estilo de vida da sociedade atual é responsável pelo aparecimento de diversas doenças tais como depressão, ansiedade, enfarte do miocárdio, entre outras. A exposição prolongada ao stress ativa uma série de processos fisiológicos com consequente alteração dos níveis de alguns biomarcadores, especialmente da hormona de cortisol que tem sido descrita como um dos principais biomarcadores para a monitorização de stress. Os níveis desta hormona são caracterizados por um ciclo circadiano com um nível máximo pela manhã e uma diminuição ao longo do dia. Este ciclo circadiano do cortisol apresenta um papel crucial na regulação de vários processos fisiológicos e, por isso, é de extrema importância monitorizar a concentração de cortisol no corpo humano, principalmente ao longo do dia, para verificar se as variações dos níveis de cortisol advêm, por exemplo, do stress crónico. Além disso, muitos estadios patológicos resultam de perturbações dos níveis de cortisol inerentes ao mau funcionamento das glândulas, como o síndrome de Cushing e doença de Addison. Desta forma, torna-se importante desenvolver ferramentas de monitorização do cortisol capazes de realizar análises rápidas ao longo do seu ciclo circadiano. O presente trabalho apresenta o desenvolvimento de um novo imunossensor microfluídico fabricado em poli(dimetilsiloxano) (PDMS) que integra sistemas de deteção ótica fabricados em CMOS (complementary metal oxide semiconductor) para a quantificação rápida e extremamente sensível de cortisol salivar. O método de recolha simples e não invasivo de amostras de saliva fornece uma alternativa interessante ao sangue, permitindo amostragens em curtos intervalos de tempo, o que é um requisito na avaliação dos níveis de cortisol ao longo do dia, sendo de igual modo relevante para muitas outras aplicações de diagnóstico clínico. A abordagem desenvolvida baseia-se num imunoensaio competitivo, no qual são imobilizados covalentemente anticorpos (Ac) de revestimento (anti-IgG policlonais) sobre a superfície do PDMS previamente funcionalizada com grupos amina. Os Ac de revestimento ligam-se à região Fc (fração constante) dos Ac específicos para o cortisol (Ac de captura) permitindo a sua correta orientação. O cortisol marcado com a enzima HRP (horseradish peroxidase) é utilizado para a quantificação, inversamente proporcional, do cortisol da amostra. Os locais de ligação aos Ac de captura vão sendo ocupados pela competição do cortisol da amostra com o cortisol marcado com HRP. Este último, ligado ao Ac de captura, é medido através da reação entre a enzima HRP e o substrato colorimétrico TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine) por absorção ótica a 450 nm, utilizando como fotodetetor um fotodíodo CMOS integrado on-chip. Com as condições otimizadas apresentadas neste trabalho, isto é, a geometria dos canais microfluídicos, os métodos de imobilização e as condições do imunoensaio, o imunossensor desenvolvido apresenta um consumo de reagentes entre 5-20 μL, uma gama linear de deteção entre 0,01-20 ng/mL com um limite de deteção de 18 pg/mL e um tempo de análise de 35 min. Assim, o imunossensor desenvolvido fornece uma alternativa vantajosa quando comparado com os métodos bem estabelecidos de análises clínicas (designados de gold-standard) apresentando grande potencial para aplicações point-of-care (POC) que requerem monitorização contínua dos níveis de cortisol salivar.The physical and psychological stress resulting from the current society's lifestyle is responsible for the appearance of several diseases, such as depression, anxiety, myocardial infarction, among others. Prolonged exposure to stress actives several physiological effects with consequent change in some biomarkers levels, especially cortisol hormone, that has been described as one of the main biomarkers for stress monitoring. Cortisol hormone levels are characterized by a circadian cycle with a morning maximum and a decrease throughout the day. This circadian cycle of cortisol plays a crucial role in various physiological processes regulation and, therefore, it is extremely important to monitor the cortisol concentration in the human body, mainly throughout the day, in order to verify if the changes that can occur in cortisol levels are a result, for example, of a chromic stress. In addition, many pathological stages result from disorders of cortisol levels inherent to the glands malfunctioning such as Cushing's syndrome and Addison's disease. Thus, it is important to develop cortisol monitoring tools capable of performing rapid analyses throughout the circadian cycle. This work presents a novel poly(dimethylsiloxane) (PDMS) microfluidic immunosensor that integrates a complementary metal oxide semiconductor (CMOS) optical detection system for a rapid and highly-sensitive quantification of salivary cortisol. The simple and non-invasive method of saliva sampling provides an interesting alternative to the blood, allowing a fast sampling at short intervals, advantageous for many clinical diagnostic applications. The developed approach is based on competitive immunoassay, where coating antibodies (anti-IgG polyclonal) are immobilized on the PDMS surface, previously functionalized with amine groups. Coating antibodies binds the Fc (constant fraction) region of the capture antibodies allowing their correct orientation. Horseradish peroxidase (HRP)- labelled cortisol is used to perform the inversely proportional quantification of the sample cortisol. The capture Ab binding sites are occupied by competition between the cortisol of the sample and the HRP-labelled cortisol. The latter, bound to the capture antibodies, is measured, after the reaction between HRP enzyme and the TMB (3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine) that produces a colorimetric substrate, through optical absorption at 450 nm, using a CMOS silicon photodiode as the photodetector. Under the developed optimized conditions presented here, e.g., microfluidic channels geometry, immobilization method and immunoassay conditions, the immunosensor shows a reagent consumption between 5-20 μL, a linear range of detection between 0.01-20 ng/mL, a limit of detection of 18 pg/mL and an analysis time of 35 min. So, the developed immunosensor provides an advantageous alternative when compared to the well-established methods of clinical analyses (gold standard) featuring a great potential for point-of-care (POC) applications requiring continuous monitoring of the salivary cortisol levels