Causes and consequences of altered microRNA levels : regulation of microRNA biogenesis and identification of microRNA-155 target genes

Abstract

Micro(mi)RNAs reguleren de expressie van een groot aantal genen en zijn daardoor betrokken bij de regulatie van bijna alle cellulaire processen. Veranderdingen in het miRNA expressie patroon is kenmerkend voor kankercellen in het algemeen en wordt ook gevonden bij B cel lymfomen. Het doel van deze studie is om te onderzoeken welke mechanismen bijdragen aan het veranderde miRNA expressie profiel en meer specifiek wat de gevolgen zijn van een veranderd miR-155 expressie nivo. We hebben de biogenese onderzocht van drie miRNAs die liggen in exonen van niet voor eiwit coderende genen. De focus was op de subcellulaire locatie van de primaire transcripten voor en na het verwijderen van de intronen. Daarnaast hebben we aangetoond dat het expressie patroon van zes miRNAs, afkomstig van het bekende oncogene miR-17~92 cluster, onderling sterk verschilden in normale B cel subsets en ook in vier veel voorkomende B cel lymfoom subtypen. In vergelijking met de normale B cel voorloper cellen bleek dat in alle vier lymfoom subtypen miR-19b het sterkste verhoogd was. Tot slot hebben we de functie van miR-155 onderzocht door de expressie van dit miRNA experimenteel te moduleren. Over expressie van miR-155 in een B cel lymfoom subtype met een lage endogene miR-155 expressie gaf een groei voordeel aan de tumor cellen, en dit effect kon worden verklaard door effectieve binding van miR-155 aan het TBRG1 transcript resulterend in een verlaagde TBRG1 expressie. MiRNAs are effective gene expression regulators that play crucial roles in most cellular processes. Altered miRNA levels are observed in almost all types of B-cell lymphoma. The aim of this thesis is to investigate possible causes of altered miRNA levels and the consequences of altered miRNA-155 levels in B-cell lymphoma. We present an overview of established mechanisms to regulate miRNA processing (chapter 2). We next studied processing of a relatively small group of miRNAs that are located in exons of noncoding RNAs (chapter 3). Based on subcellular location and overexpression experiments we concluded that miRNAs are processed predominantly from the unspliced transcripts that almost completely reside in the nucleus. In chapter 4, we studied processing of the oncogenic miR-17~92 cluster in normal B cell subsets and in four B-cell non-Hodgkin lymphoma (NHL) subtypes. We observed marked differences between the levels of the six miRNAs in the B cell subsets and the NHL subtype. In comparison to their normal counterparts all lymphoma subtypes showed a marked induction of miR-19b. In chapter 5, we describe a straight-forward method to generate viral miRNA sponge constructs that can be used to inhibit miRNA functioning. In chapter 6, we studied the consequence of altered miR-155 expression levels in B-cell lymphoma. Induction of miR-155 revealed a significant growth advantage of the tumor cells. Using Ago2-RIP-Chip and phenotype copy experiments we showed that TBRG1 is one of the miR-155 targets. Inhibition of TBRG1 also induced a growth advantage similar to the miR-155 effect.