Funktionale Analyse der EHD-Proteine bei tubulären Transportprozessen

Abstract

Der intrazelluläre Transport von Molekülen wird nicht nur über vesikuläre Systeme, sondern auch über tubuläre Transportstrukturen gesteuert. Tubuläre Abschnürungen von Kompartimentmembranen spielen einerseits bei den sekretorischen Organellen, wie ER und Golgi-Apparat eine Rolle, sind anderseits auch für die endocytotische Aufnahme von GPI-verankerten Proteinen oder den MHCI verantwortlich. Die tubulären Strukturen dienen zum Transport von großen Frachtmolekülen oder zur Reorganisation großer Flächen von Membran-Mikrodomänen. Für die tubuläre Endocytose des MHCI wurde ein Arf-6-induzierter Weg beschrieben, für den auch die Beteiligung des Proteins EHD1 essentiell ist. EHD1 gehört zu einer Proteinfamilie, die aus vier Mitgliedern besteht und assoziiert endogen und nach Überexpression an den Membranen der tubulären Transporter. Alle EHD-Proteine weisen den gleichen Domänenaufbau auf, wobei die beiden Hauptdomänen, die N-terminale G-Domäne und die C-terminale EH-Domäne bei allen Familienmitgliedern hoch-konserviert sind. Ziel dieser Arbeit war eine allgemeine Hypothese zur Funktion der EHD-Proteinfamilie zu überprüfen, wonach sie über die G-Domäne Nukleotid-abhängig an den Membranen von Transportstrukturen oligomerisieren bzw. die Bildung der tubulären Strukturen auslösen und daß die Interaktion über ihre EH-Domäne mit den NPF-Motifen der Bindungspartner das Andocken oder Ablösen der Transport-Carrier an ein oder von einem Kompartiment ermöglicht. Zunächst wurde ein Vergleich der Expression und intrazellulären Lokalisation der EHD-Proteine vorgenommen, wonach alle vier Familienmitglieder an tubulären Transportern assoziieren. Unter Verwendung von Punktmutanten der Nukleotid-Bindungsdomäne und Wildtyp EHD1 konnte eine enzymatische Aktivität gezeigt werden, die bei der Punktmutante EHD1 T72N herabgesetzt ist, welche den konstitutiv-inaktiven, GDP-bindenden Zustand der GTPase widerspiegeln soll. Des Weiteren zeigten alle vier EHD-Proteine in vitro eine direkte Bindung an mit Phosphoinositiden-angereicherten Liposomen, wobei die Bindung durch Deletion der G-Domäne oder Verwendung der Punktmutante EHD1 T72N verhindert wird. GST-EHD1 hat außerdem eine membran-modulierende Funktion, da es in vitro Liposomen tubulieren kann. Eine Nukleotid-abhängige Oligomerisierung der EHD-Proteine wurde während der Durchführung dieser Arbeit von Lee et al. (2005) und Naslavsky et al. (2006) publiziert und wurde deshalb hier mit den eigenen Daten zur Oligomerisierung verglichen. Die Transport-Funktion der EHD-Proteine wurde exemplarisch an EHD4 in humanen Hepatoma Zellen (Huh-7) untersucht. EHD4 wt zeigte eine Assoziation an tubuläre Strukturen, über die spezifisch ein GPI-GFP-Konstrukt transportiert wird. Das EHD4-Äquivalent zur in vitro Lipidbindungs-defizienten EHD1-Punktmutante, EHD4 T75N zeigte nach Überexpression keine Assoziation mehr an Membranen. Die Deletion der C-terminalen EH-Domäne führt nach Überexpression zu einer Akkumulierung am ER, wodurch der Transport von verschiedenen getesteten Frachtmolekülen von den sekretorischen Ausgangsstellen des ER inhibiert wird. Dies führt zu einer Zerstörung des Golgi-Apparates und schließlich zur kompletten Blockade der Sekretion