Zur DNA Sequenz eines klinischen Isolaten ähnlichen HCMV (Humanes Cytomegalievirus) Stammes (Toledo): Veränderte Leserahmen durch zusätzliche Startkodons?

Abstract

Die DNA Sequenzen klinischer Isolate des Humanen Cytomegalievirus (HCMV) und des klassischen Laborstammes AD169 können stark voneinander abweichen. Da es für HCMV nur begrenzte Therapiemöglichkeiten gibt und eine Immunisierung bis heute nicht möglich war, sollten über Sequenzvergleiche zwischen HCMV AD169 und HCMV Toledo Gene identifiziert werden, die Ansatzpunkte für eine Therapie der Virusinfektion bieten. In der vorliegenden Arbeit haben wir einen Großteil der DNA Sequenz des klinischen HCMV Isolates Toledo bestimmt, die Aminosäuresequenzen von 127 Offenen Leserahmen (ORFs) ermittelt und mit den Sequenzen des Laborstammes HCMV AD169 verglichen. Ausgehend von aufgereinigter, aus Virionen isolierter DNA des HCMV Stammes Toledo, wurde die DNA Sequenz des klinischen Isolaten ähnlichen Stammes über eine "genome walking" Methode erschlossen. Für die Sequenzierung wurden AD169 Sequenz homologe Primer verwendet. Ein Vergleich der DNA Sequenzen von HCMV AD169 und HCMV Toledo zeigte Basenpaaraustausche, sowie Deletionen und Insertionen. Mehrere ORFs wiesen NH2-terminale Extensionen der kodierenden Regionen auf, die bis zu 123 Aminosäuren lang sein konnten. Einige dieser Extensionen waren hochgradig homolog zwischen den beiden untersuchten HCMV Stämmen. Sechs dieser Extensionen begannen mit AUG, 24 mit CUG und 21 mit GUG, die alle als Translationsstartpunkte in Pro- und Eukaryoten bereits nachgewiesen worden sind. Einige der gefundenen verlängerten Sequenzen könnten veränderte Funktionalitäten in den betroffenen Proteinen bewirken und waren ebenfalls nachweisbar in drei anderen klinischen Isolaten und dem Laborstamm Towne. Es konnte gezeigt werden, daß einige der alternativen Sartkodons in einem Sequenzumfeld lagen, das ihre Benutzung begünstigt, da das postulierte Kozak-Motiv vorkam. Zudem konnte nachgewiesen werden, daß einige der alternativen Startkodons auf den mRNAs vorhanden waren, die in von HCMV infizierten HFF Zellen produziert wurden. Der Beweis der Proteinsynthese über die alternativen Starkodons konnte bis jetzt nicht definitiv erbracht werden, da durchgeführte Expressionsstudien aufgrund technischer Schwierigkeiten bisher noch keine eindeutigen Daten erbracht haben