Homologe archaeale Holliday-Struktur auflösende Endonukleasen und ihre spezifischen Reaktionen mit cruciformer DNA

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wird die Identifikation, Klonierung und Reinigung von acht homologen Holliday-Struktur auflösenden Endonukleasen (Hjcs) aus Archaeen und zwei homologen Hjcs aus archaealen Viren, sowie ihre spezifischen Reaktionen mit cruciformer DNA beschrieben. Die gereinigten Hjcs wurden in vergleichende Untersuchungen mit synthetischen cruciformen DNAs eingesetzt. Dabei zeigten alle Hjcs die erwartete, typische Auflösungsreaktion. Es konnte ein strukturabhängiger Schnittmodus abgeleitet werden, der sich zwischen den zellulären und den viralen Hjcs durch die Positionen der eingefügten symmetrischen Einzelstrangbrüche unterschied. Die zellulären Hjcs zeigten identische Schnittmuster mit einer cruciformen DNA mit fixiertem Kreuzungspunkt, unterschieden sich aber deutlich in ihren Reaktionen mit einer cruciformen DNA, die branch migration über einen Bereich von zehn Basenpaaren zuließ. Um Bereiche der Hjcs zu identifizieren, die für diese Spezifitäten verantwortlich sind, wurden drei hypothetische DNA-Interaktionsdomänen eines Hjcs einzeln und in Kombination in ein anderes Hjc mit stark abweichendem Schnittmuster übertragen. In Reaktionen mit mobiler cruciformer DNA zeigten die chimären Hjcs individuelle Schnittmuster, die sich von den Schnittmustern aller natürlicher Hjcs unterschieden. Dies zeigte den Einfluß der hypothetischen DNA-Interaktionsdomänen auf die Substratspezifität der Hjcs. Die archaealen Hjcs wurden in Experimenten zur Komplemention von Endonuklease VII des Bakteriophagen T4 eingesetzt. Die Fähigkeit der Hjcs zur Komplementation von Endo VII ließen Rückschlüsse auf die Funktion von Endo VII zu und bestätigten die biologische Funktion der Hjcs als X-Solvasen in einem in vivo-System