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Untersuchungen zur Rolle von Cytochrom P450-Enzymen in der Biosynthese von Aryltetralin-Lignanen in Zellkulturen von Linum spec.

By Stephan Kuhlmann

Abstract

Lignane sind phenolische Verbindungen des pflanzliche Sekundärstoffwechsels, die sich von der Aminosäure Phenylalanin ableiten, über das Pflanzenreich weit verbreitet sind und die vielfältige pharmazeutisch-medizinische Bedeutungen haben können. Podophyllotoxin (PTOX), ein Aryltetralin-Lignan, ist stark cytotoxisch und dient u.a. als Ausgangs-substanz der halbsynthetischen Glycoside Etoposid und Teniposid, die als Chemotherapeutika eingesetzt werden. Wildsammlungen von Podophyllum spec. stellen momentan die hauptsächliche Bezugsquelle für Podophyllotoxin dar. Außerdem konnten Aryltetralin-Lignane auch in einigen Leinarten (Linum spec.) nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit werden Untersuchungen zur Biosynthese von Lignanen wie PTOX oder 6-Methoxypodophyllotoxin (MPTOX) in Suspensionskulturen von Linum album, L. flavum und L. nodiflorum beschrieben. Ein besonderer Schwerpunkt der Arbeit liegt auf der Rolle beschriebener oder vermuteter Cytochrom P450-abhängiger Oxygenasen, einer Enzymklasse, die viele oxidative Reaktionen im pflanzlichen Sekundärstoffwechsel katalysiert. Biotransformationsversuche in L. nodiflorum deuten darauf hin, dass der Umsatz von Desoxypodophyllotoxin (DOP) zu PTOX durch eine DOP7H Cytochrom P450-abhängig sein könnte, da er durch den spezifischen Inhibitor Tetcyclacis gehemmt wird. In Mikrosomen-präparationen aus Linum nodiflorum war keine DOP7H-Aktivität nachweisbar. Die kürzlich in L. flavum beschriebene Desoxypodophyllotoxin 6-Hydroxylase (DOP6H), die den Umsatz von DOP zu -Peltatin katalysiert, konnte in Zellkulturen von L. nodiflorum nachgewiesen und in zellfreien Extrakten charakterisiert werden. Ihre höchste Aktivität weist die DOP6H aus L. nodiflorum bei pH 7,4 und etwa 35 °C auf. Die hemmende Wirkung verschiedener Cytochrom P450-spezifischer Inhibitoren, wie Cytochrom c oder Tetcyclacis wurde gezeigt. Außerdem konnten hemmende Effekte des Substratanalogons 4’-Demethyl-DOP, sowie divalenter Kationen, insbesondere Mn2+ festgestellt werden. Als Km-Werte für das Substrat Desoxypodophyllotoxin (DOP) und das Cosubstrat NADPH wurden 8,3 µM und 47 µM ermittelt. Die Bedeutung des alternativen Cosubstrats NADH wurde untersucht, wobei kein synergistischer (überadditiver) Effekt festgestellt werden konnte, wie er von vielen tierischen und humanen Cytochrom P450-Systemen bekannt ist. Die geringe Enzymaktivität mit NADH verweist auf eine mögliche Beteiligung von Cytochrom b5 an der Elektronen-transport-kette zur DOP6H in vitro. Außerdem werden Ansätze zur biotechnologischen Verwendbarkeit der DOP6H, wie die Verwendung von Zn/Co(III)-Sepulchrat als alternative Elektronendonatoren anstelle von NADPH und eine Aufreinigungsstrategie über eine Affinitäts-chromato-graphie mit Hilfe des Substratanalogons 4’-Demethyl-DOP diskutiert. Yatein gilt als mögliche direkte Vorstufe von DOP in der Lignan-Biosynthese. Ein Umsatz von Yatein zu DOP, wie in Podophyllum spec. beschrieben, konnte in den untersuchten Zellkulturen nicht nachgewiesen werden. Dies kann als Hinweis darauf gewertet werden, dass die Biosynthesewege in den Gattungen Linum und Podophyllum unterschiedlich verlaufen könnten. Die mögliche Bedeutung von Yatein wird diskutiert. Zusätzlich wurde damit begonnen NADPH:Cytochrom P450-Reduktasen (CPR) aus den genannten Zellkulturen zu klonieren. Für den Ablauf Cytochrom P450-abhängiger Reaktionen sind diese Reduktasen als Elektronendonatoren notwendig. Durch RT-PCR konnten mit Hilfe genspezifischer Primer Teilklone für CPRs aus L. album, L. flavum und L. nodiflorum isoliert werden. DOP scheint ein Verzweigungspunkt in der Lignan-Biosynthese zu sein, da es eine Vorstufe sowohl von PTOX als auch MPTOX ist. Das genauere Verständnis der enzymatischen Umsetzung von DOP ermöglicht eine Abschätzung des bio-techno-logischen Potentials der Lignan-Biosynthese in Zellkulturen von Linum spec

Topics: Lignane ; Cytochrome P450 ; Lignans ; Lein ; Podophyllotoxin ; Desoxypodophyllotxin ; Linum nodiflorum ; Cytochrom P-450 ; Podophyllotoxinderivate ; Zellkultur ; Medical sciences, Medicine, Lignane -- Cytochrome P450 -- Lignans -- Lein -- Medizin, Gesundheit -- Podophyllotoxin -- Desoxypodophyllotxin -- Linum nodiflorum -- Cytochrom P-450 -- Podophyllotoxinderivate -- Zellkultur, ddc:610
Publisher: Philipps-Universität Marburg, Fachbereich Pharmazie
Year: 2004
OAI identifier: oai:Archiv.UB.Uni-Marburg.de:04-z2004-0485

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