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Flowzytometrische Untersuchung der Apoptose humaner Spermatozoen mit Hilfe des Annexin V-Tests

By Arne Leschner

Abstract

Zielsetzung : Die Präsentation des Phospholipids Phosphatidylserin (PS) an der äußeren Zellmembran ist ein Prozess der Frühphase der Apoptose in humanen Zellen. Diese Veränderungen können mit dem Annexin V-Test flowzytometrisch nachgewiesen werden. Ziel dieser Studie war es, nach Inkubation von Spermatozoen mit unterschiedlichen Einflussfaktoren die Bindungsraten von Annexin V zu ermitteln und dadurch einen Einfluss auf die Spermienapoptose nachzuweisen. Im speziellen wurde der Einfluss von Fas-Antikörpern, von Antispermien-Autoantikörpern (ASA) und der Akrosomreaktion mit Hilfe des Kalziumionophors A23187 untersucht. Des weiteren wurde untersucht, ob sich Fas-Apoptoserezeptoren an der Membran von Spermatozoen flowzytometrisch nachweisen lassen. Aufbau der Experimente: 1. Die gewaschenen Spermien wurden mit 2 verschiedenen Fas-Antikörper Klonen für 4 Stunden inkubiert, gefolgt von einem weiteren Waschschritt und dem Annexin V-Test. Flowzytometrisch wurde die direkte Bindung von CD95-PE an Fas-Rezeptoren sowie die Annexin V-Bindungsraten nach Inkubation mit den Fas-Klonen ausgewertet. 2. Die Ejakulate wurden nach Swim-up Vorbehandlung für 2 Stunden inkubiert und anschließend mit dem Kalziumionophor A23187 behandelt. Nach einem Waschschritt wurde der Annexin V-Test durchgeführt. Ausgewertet wurden die Gesamtraten der Annexin-V-Bindung, die Anzahl Akrosom-reagierter Zellen nach Ionophor-Einwirkung mit Hilfe des konjugierten Antikörpers gegen die innere Akrosommembran CD46-FITC, und die Bindung von Annexin V an Akrosom-reagierte Zellen. 3. 2 Ejakulate wurden durch einfache Zentrifugation und 2 Ejakulate durch Swim-up Präparation vorbehandelt und die Ansätze mit ASA-enthaltendem Seminalplasma oder ASA-enthaltendem Blutserum für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurden die Bindungsraten von ASA an die Spermatozoen mit Hilfe des MAR-Tests ermittelt, nach einem Waschschritt der Annexin V-Test durchgeführt und die flowzytometrischen Annexin V-Bindungsraten mit den MAR-Test Ergebnissen in Verbindung gesetzt. Für alle Testreihen wurde eine flowzytometrische Analyse durchgeführt und für alle Ansätze eine Vitalfärbung mit 7-Amino-Actinomycin D vorgenommen. Avitale Zellen wurden von der Analyse ausgeschlossen. Ergebnisse: 1. Nach Inkubation mit den Fas-Antikörper-Klonen konnte nur ein äußerst geringes Vorkommen von Fas-Rezeptoren ermittelt werden, im Mittel 1,46% der vitalen Zellen. Ein Einfluss auf die Annexin-V-Bindungsrate von vitalen Spermatozoen ließ sich nach der Antikörperinkubation nicht nachweisen. 2. Die Ansätze, welche mit A23187 inkubiert worden waren, zeigten im Mittelwert eine Rate von Annexin-V-gebundenen vitalen Zellen an allen vitalen Zellen von 42,17%, nachdem die entsprechenden Raten der Kontrollproben abgezogen worden waren. Ansätze, die mit dem Kalziumionophor behandelt und gleichzeitig mit CD46-FITC und Phycoerythrin-konjugiertem Annexin V gefärbt worden waren, konnten aufgrund einer unerwarteten Verschiebung der Gesamtpopulation in das avitale Spektrum der flowzytometrischen DotPlot-Auswertung nicht auf eine gleichzeitige Annexin-Bindung akrosom-reagierter Zellen ausgewertet werden. Vitale Spermatozoen mit spontaner Akrosomreaktion ohne Ionophor-Einwirkung konnten analysiert werden und zeigten eine gleichzeitige Annexin V-Bindungsrate von im Mittel 32,12%. 3. Nach ASA-Inkubation ließ sich keinerlei Einfluss auf den Anteil vitaler Spermatozoen mit Annexin-V-Bindung feststellen. Schlussfolgerungen: 1. Nur ein sehr geringer Anteil von Fas-präsentierenden Spermatozoen konnte ermittelt werden. Fas-Antikörper führten bei Spermatozoen nicht zu einer erhöhten Rate von PS-Präsentation als Zeichen der frühen Apoptose. Offensichtlich ist der Fas-Reaktionsweg der Apoptose bei reifen Spermatozoen nicht funktionsfähig. Diese Ergebnisse unterstützten die Theorie, dass auf dem Weg der Keimzellentwicklung der größte Anteil Fas-tragender Zellen eliminiert wird und verbliebene Fas-Rezeptoren auf reifen Spermatozoen nicht funktionelle Residuen darstellen. 2. Die Einwirkung von A23187 erhöht eindeutig den Anteil von Spermatozoen, die PS an ihrer Zellmembran präsentieren. Unklar bleibt, ob diese Veränderungen die Frühphase der Apoptose wiederspiegeln oder ob die erhöhte PS-Präsentation sich alternativ auf die Membranveränderungen der Akrosomreaktion zurückführen läßt. Der erhöhte Anteil vitaler spontan Akrosom-reagierter Spermatozoen mit gleichzeitiger Annexin V-Bindung unterstützt diese Annahme. Letztere Erklärung stellt die Eignung des Annexin V-Tests als spezifischer Test für Apoptose für Spermatozoen in Frage, da es bei diesen haploiden Keimzellen zu nicht-apoptotischen Membranveränderungen mit PS-Expression kommen kann. 3. ASA scheinen keine Rolle für die PS-Expression bei Spermatozoen zu spielen

Topics: Durchflusscytometrie ; Annexin V ; Spermatozoa ; Fas-Ligand ; Fas-Rezeptor ; Phosphatidyl-serin ; Akrosomreaktion ; Akrosom ; Fas receptor ; 7-AAD ; Spermienapoptose ; Apoptose ; Flow cytometry ; Spermium ; Spermatozoenapoptose ; Antigen CD95 ; Apoptosis ; Medical sciences, Medicine, Durchflusscytometrie -- Annexin V -- Annexin V -- Spermatozoa -- Fas-Ligand -- Fas-Rezeptor -- Phosphatidyl-serin -- Akrosomreaktion -- Akrosom -- Fas receptor -- 7-AAD -- Spermienapoptose -- Apoptose -- Flow cytometry -- Spermium -- Spermatozoenapoptose -- Medizin, Gesundheit -- Antigen CD95 -- Apoptosis, ddc:610
Publisher: Philipps-Universität Marburg, Medizin
Year: 2006
OAI identifier: oai:Archiv.UB.Uni-Marburg.de:04-z2006-0457

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