Biodegradation of ibuprofen and fluoxetine by bacterial strains isolated from environmental samples and identification of candidate catabolic genes

Pharmaceuticals are commonly found in surface waters due to high global demand. Conventional wastewater treatment plants don’t remove them completely being a major source of these compounds, which pose a risk to the environment and human health despite their low concentrations. The objective of the present investigation was to isolate bacteria from environmental and wastewater samples from the Algarve area potentially exposed to recalcitrant contaminants (aromatic compounds), capable of degrading pharmaceuticals. Ibuprofen (IBU) and fluoxetine (FLX), two of the most common drugs found in effluents worldwide, were the targets. Twenty bacterial strains were isolated using enrichment cultures. However, only three strains (TIBU2.1, LOI1.1 and LOI1.2) showed the ability to degrade IBU, and two (LOFLX1.1 and LOFLX1.3) FLX. The drug concentration was monitored by HPLC, as well as the presence of IBU metabolites eventually formed during biodegradation. In addition, two bacterial strains (Mycolicibacterium aubagnense HPB1.1 and Micrococcus yunnanensis TJTP4), previously isolated for other pharmaceuticals, were investigated in this work. Klebsiella pneumoniae TIBU2.1 and M. yunnanensis TJTP4 exhibited complete degradation of IBU after 15 and 14 days, respectively, while M. aubagnense HPB1.1 was also able to degrade 60.2% ± 0.4 of IBU after 21 days. Additionally, the complete genomes of these three bacterial strains were sequenced to conduct a preliminary analysis of candidate genes involved in the degradation pathway of IBU. Catabolic enzymes reported in databases and literature for IBU biodegradation were used to search for similar proteins translated by the obtained genome sequences. These in silico analyses on the bacterial genomes showed similarities with most of the reported proteins. This work provides useful genetic information for the development of bioaugmentation techniques and reports new bacteria for bioremediation processes transforming IBU into less toxic metabolic compounds.Os produtos farmacêuticos constituem um mercado em crescimento, altamente procurado ano após ano, o que faz com que estes compostos sejam continuamente detetados nos efluentes e nas águas superficiais. Apesar desses compostos poderem chegar ao ambiente através de diferentes fontes, as estações de tratamento de águas residuais (ETARs) são incapazes de os eliminar completamente, sendo por isso a maior fonte de contaminação ambiental destes poluentes. Foi demonstrado que, apesar das baixas concentrações de descarga presentes nas águas residuais (de ng L-1 a μg L-1), a sua presença nos ecossistemas representa um risco para o meio ambiente e para a saúde humana. A utilização de processos de bioaumentação e bioestimulação apresentam-se como técnicas promissoras para a eliminação desses contaminantes. Para alcançar esse objetivo é fundamental isolar bactérias que possuam a capacidade de degradação dessas substâncias. Além disso, o entendimento da via de degradação e dos genes envolvidos pode ser útil no desenvolvimento de ferramentas a ser utilizadas na bioaumentação de bactérias, ou bioaumentação genética por transferência horizontal de genes de enzimas catabólicas em plasmídeos. Assim, o objetivo principal deste trabalho, a fim de melhorar os processos de tratamento de águas residuais, foi isolar estirpes bacterianas com a capacidade de degradar o anti-inflamatório monocíclico não esteroidal ibuprofeno (IBU) e o antidepressivo fluoxetina (FLX), dois medicamentos comumente encontrados nos efluentes de águas residuais que acabam no mar. Estas bactérias foram isoladas de amostras de sedimentos ambientais de diferentes pontos da região do Algarve, potencialmente afetados por contaminantes recalcitrantes como a gasolina e óleos lubrificantes e também de águas residuais de lagar de azeite – águas ruças - e seus sedimentos, uma vez que estes contêm compostos com aneis aromáticos, tal como o IBU e a FLX. Para selecionar bactérias potencialmente degradadoras foram feitos enriquecimentos em solução aquosa com meio mineral salino (MSM) suplementado com altas concentrações de IBU e FLX (100 mg L-1), a partir dos quais foram isoladas em placa um total de 20 estirpes bacterianas (11 para IBU e 9 para FLX) com diferenças morfológicas entre elas. Dessas apenas 3 (TIBU2.1, LOI1.1 e LOI1.2) foram capazes de degradar IBU e 2 (LOFLX1.1 e LOFLX1.3) FLX, em solução aquosa. Para além dos novos isolamentos obtidos neste trabalho, também foi avaliado o potencial de degradação de duas bactérias previamente isoladas para outros fármacos no laboratório de Tecnologias Ambientais do CCMAR onde decorreu o trabalho: Mycolicibacterium aubagnense HPB1.1 e Micrococcus yunannensis TJPT4.(...

PolyQ Database - A polyglutamine disease database

Polyglutamine diseases are neurodegenerative disorders where the associated genes and translated protein products have an abnormal number of CAG triplets and glutamines, respectively. Mutated proteins with increased number of glutamines are usually correlated with neuronal dysfunction. Depending on the length of the pathogenic mutation, the effects on the normal cell mechanisms may be less or more severe, in other words, the severity of the disease is usually directly proportional with the number of glutamine repeats. There are 9 polyglutamine diseases: Huntington’s disease (HD), dentatorubral-pallidoluysian atrophy (DRPLA), spinal and bulbar muscular atrophy (SBMA) and the spinocerebellar ataxias (SCAs) 1, 2, 3, 6, 7 and 17. All these diseases are caused by the same mutation in their respective, and otherwise unrelated, genes – CAG triplet expansion. This abnormal triplet expansion is found in coding gene regions and later gives rise to the expanded glutamine sequence in the translated proteins. Mutated proteins with an increased number of glutamines often interfere with the normal cellular function by not performing their normal tasks and by compromising crucial cell mechanisms. PolyQ Database is a project that aims to be an online resource where everyone can learn about the most important features of every polyglutamine disease. Since information on each specific disease is usually scattered throughout various online sources, one of the main goals is to have all the most important information in one single online resource. The data available in PolyQ Database consists of simple and straightforward introductory information followed by more complex explanations about the genes and proteins affected in each disease, along with the pathophysiological mechanisms and cellular and biological deficits that may arise from these. This platform was done with hypertext markup language, cascading style sheets and JavaScript for the front-end (what the user interacts with). The back-end structure was entirely made with python Django framework. All the data stored for each disease was initially stored in an object oriented SQlite3 database created with Django but was later imported to a Microsoft SQL server. To obtain a scientific database structure with consistent and constant slices of information, the same data was presented for each polyglutamine disease. For each condition, the topics presented are: introduction, first description, epidemiology, causative gene, codified protein (structure, domains, functions and intracellular localization), pathophysiology and clinical manifestations (neuropathology, other signs and symptoms). The PolyQ Database can be found at https://polyq.pt/, where all the information gathered from various sources is presented, along with added supplementary pages, including a contact and authors pages, and a home page to search the diseases using either a search engine or disease tags.As doenças de poliglutaminas são um conjunto de doenças neurodegenerativas associadas à presença de sequências anormalmente longas de glutaminas em proteínas particulares. Este número elevado de glutaminas é consequência da repetição anormal de tripletos CAG existentes na parte codificante de genes respetivos, que são posteriormente traduzidos para proteína. Sequências de repetições de CAG com maior tamanho estão diretamente relacionados com uma maior probabilidade de desenvolver doença e com uma severidade das manifestações clínicas. O mecanismo principal que parece estar na origem destas doenças é a expansão de repetições do trinucleotídeo CAG, em que expansões anormais surgem de mutações indel, ou simplesmente, mutações de inserção ou deleção. O principal mecanismo por detrás destas mutações indel é o slipped strand mispairing (SSM). SSM é um tipo de mutação que pode ocorrer durante a replicação de DNA e que envolve vários processos que causam mutações ligeiramente diferentes. No caso das doenças de poliglutaminas, a repetição anormal de CAG dever-se-á ao facto de a DNA polimerase, ao sintetizar a nova cadeia, dar “um salto” para trás e copiar novamente o que já foi copiado. As proteínas traduzidas a partir destes genes mutados podem comprometer vários processos celulares, que estão relacionados com o desenvolvimento das respetivas doenças. Proteínas com um número elevado de glutaminas são geralmente menos eficientes a executar as suas funções normais comprometendo assim vários processos celulares em que participam. Com o aumento anormal de glutaminas, existe também a possibilidade de as proteínas se envolverem em novos processos celulares, com os quais, em situações normais, não se envolveriam. Outra característica de diversas doenças de poliglutaminas é a existência de agregados citoplasmáticos e nucleares (inclusões nucleares) que contêm a proteína mutada. Estas agregados podem sequestrar outras proteínas importantes e criar agregados macromoleculares que a célula não tem capacidade de degradar. A formação de agregados/inclusões no interior do núcleo pode interferir com o normal funcionamento de vários processos nucleares, nomeadamente a transcrição. Existem nove doenças de poliglutaminas extensamente relatadas e identificadas: doença de Huntington, atrofia dentatorubro-palidoluisiana, atrofia muscular espinhal-bulbar e as ataxias espinocerebelosas 1, 2, 3, 6, 7 e 17. Cada uma destas doenças é causada pela expansão de um gene e de uma proteína particulares, e está associada a degeneração de zonas específicas do sistema nervoso e a mecanismos patofisiológicos distintos, apresentando por isso diferentes sinais pelos quais é possível diferenciar e classificar cada uma das doenças de poliglutaminas. No entanto, considera-se que certos mecanismos patogénicos e sinais neuropatológicos são comuns às nove doenças. As manifestações clínicas das doenças de poliglutaminas são diversas, e variam de acordo com as estruturas afetadas. Por exemplo, a coreia, no caso da doença de Huntington, e a ataxia, no caso das ataxias espinocerebelosas, surgem respetivamente da decadência funcional dos gânglios basais e do cerebelo, respetivamente. No entanto, estas doenças acabam também por exibir sintomas em comum, que normalmente surgem no decorrer da doença ou em fases mais tardias, como a demência, a fraqueza muscular, epilepsia e convulsões e deficiências cognitivas. O projeto PolyQ Database teve como objetivo o estabelecimento de uma plataforma que permitisse um acesso fácil a todas as informações importantes acerca de cada uma das doenças de poliglutaminas, num mesmo local. Essa plataforma foi feita com hypertext markup language, cascading style sheets e JavaScript para o front-end (com o que o usuário interage). A estrutura de back-end foi inteiramente feita com o framework Django do Python. Todos os dados armazenados para cada doença foram inicialmente armazenados num banco de dados SQlite3 orientado a objetos criado com Django, mas posteriormente foram importados para um servidor Microsoft SQL. De acordo com a estrutura estabelecida, foi desenhado um website que apresenta, para cada uma das 9 doenças, uma parte introdutória seguida pela informação acerca das suas primeiras descrições históricas e por dados epidemiológicos. De seguida, são apresentadas diversas informações acerca do gene afetado e da proteína traduzida (estrutura, funções e localização intracelular). Por fim, são apresentados os mecanismos celulares afetados que levam ao desenvolvimento da doença e os sinais/sintomas observados em pessoas afetadas. A PolyQ Database está disponível em https://polyq.pt/ ,onde se apresenta toda a informação recolhida de várias fontes, de acordo com a estrutura descrita. O website apresenta ainda outras páginas suplementares, como a página de contato e página dos autores. A página home permite ao utilizador aceder à informação acerca das diversas doenças através de um motor de busca ou por escolha direta de qualquer doença disponível por marcadores opcionais

A survey on ISO 9001 decertified companies: the three stages leading to withdrawal

This study investigates the three main stages of the ISO 9001 certification process (implementation, maintenance, and withdrawal) from the perspective of decertified firms. The research employs a descriptive and inductive survey methodology, drawing insights from a literature review and the analysis of primary data obtained from a sample of decertified organisations. Results suggest that the decertification is triggered during the pre-certification stage, where these firms overemphasise external motivations to the detriment of internal ones. Additionally, this study finds that, in the maintenance stage, these firms are unable to commit to continuous improvement. The interplay of external motivations, the lack of internalisation and continuous improvement, and the nature of benefits gained by these entities ultimately leads to certification withdrawal. Furthermore, the paper highlights that the consequences of decertification vary: most firms report no negative impact on their performance, but some report a negative impact, which seems to result from even stronger external motivations. This is the first descriptive (and inductive) study to address decertification from the dual perspective of the whole certification process and of the decertified firms, adding to the scarce research on decertification by providing a comprehensive overview of this phenomenon and identifying a holistic explanation for the withdrawal.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Protein synthesis and aging: is translation rate a major regulator?

O envelhecimento é um processo biológico universal caracterizado por uma acumulação de danos e outros efeitos nocivos que levam a uma perda progressiva da integridade fisiológica e funcional que culminam na morte do organismo. As alterações que acompanham o envelhecimento ocorrem nos diversos níveis da organização do ser vivo, ou seja, a nível molecular, dos organelos, celular, dos tecidos, órgãos e sistemas. O envelhecimento constitui um dos fatores principais das patologias humanas, como o cancro, a diabetes, doenças cardiovasculares e doenças neurodegenerativas, nomeadamente, as doenças de Alzheimer e Parkinson. Por esta razão e o aumento progressivo da população idosa, nas últimas décadas têm ocorrido um aumento e progresso na investigação focada no envelhecimento. Notavelmente, ao longo das últimas décadas, tem ocorrido uma mudança gradual no foco da investigação sobre o envelhecimento, ao invés de focar-se nos efeitos e sintomas do envelhecimento, tem-se concentrado nos mecanismos moleculares subjacentes ao processo de envelhecimento. Esta nova abordagem levou à descoberta de que a taxa de envelhecimento é controlada, pelo menos até certo ponto, por vias genéticas e processos bioquímicos conservados na evolução, o que permitiu identificar e categorizar as características celulares e moleculares do envelhecimento, sendo estes definidos como os biomarcadores do envelhecimento. Foram propostos nove biomarcadores do envelhecimento: instabilidade genómica, encurtamento dos telómeros, alterações epigenéticas, perda de homeostasia proteica, desregulação da sensibilidade de nutrientes, disfunção mitocondrial, senescência celular, exaustão das células estaminais, alteração da comunicação intercelular. De entre os diversos mecanismos moleculares que impactam o envelhecimento, as alterações que afetam o proteoma celular têm um papel fulcral. Quase todos os processos fisiológicos são dependentes de proteínas e, portanto, a preservação da integridade do proteoma é imperativa para a vida do organismo. Vários fatores especializados são dedicados a preservar a integridade do proteoma celular, desde o processo de pré-tradução até o final do ciclo de vida funcional da proteína. A manutenção da homeostase celular correlaciona-se diretamente com a manutenção de um equilíbrio preciso da síntese, degradação e função de cada proteína. Quando esse equilíbrio é perturbado, as proteínas danificadas se acumulam progressivamente, levando a um estado prejudicial e até mesmo à morte celular. O distúrbio deste equilíbrio ocorre naturalmente com o envelhecimento, à medida que a integridade e a eficácia da maquinaria da síntese proteica e dos sistemas de controlo de qualidade das proteínas diminuem gradualmente devido ao inevitável acúmulo de danos com a idade. Em particular diversos estudos demonstram que a síntese proteica reduz com a idade em diversos organismos, tendo-se observado uma redução de diferentes componentes da maquinaria de tradução, nomeadamente, abundância dos ribossomas e atenuação da atividade e dos níveis dos principais fatores de iniciação e alongamento. Apesar destas descobertas e do crescente número de estudos, vários aspetos da síntese proteica no contexto do envelhecimento permanecem elusivos, especialmente a nível mecanístico. Neste sentido, o presente estudo tem como objetivo elucidar o papel da síntese proteica e do controle da tradução no envelhecimento e na expectativa de vida, assim como compreender a sua conexão funcional com os vários biomarcadores do envelhecimento. Para isso, analisou-se o perfil da taxa global de tradução em modelos celulares. De modo a estabelecer uma ligação entre o envelhecimento e a síntese proteica focamos na proteína de ligação a poliadenilato 1 (PABP1), uma proteína central no controle da tradução e estabilidade de mRNA. Esta proteína promove a circularização do mRNA, levando à estabilização e estimulação da iniciação da tradução. Por isso, PABP1 poderá desempenhar um papel fulcral na mediação de mudanças na síntese proteica com o envelhecimento. Para o estabelecimento da relação entre síntese proteica e o envelhecimento, primeiramente analisou-se a variação do PABP1 com o envelhecimento em modelo celular e em morganhos. Seguidamente, o PABP1 foi sobre-expresso no hipotálamo de morganhos envelhecidos e analisou-se diferentes proteínas ligadas ao envelhecimento, nomeadamente: mTOR, relacionado à desregulação da sensibilidade de nutrientes; Ataxina-2, referente à tradução de mRNA; LC3B e P62, alusivo à perda de homeostasia proteica; IL-6 e NF-κB, concernente à alteração da comunicação intercelular, particularmente, inflamação; e por fim PGC-1α, respeitante à disfunção mitocondrial. O hipotálamo foi o foco da sobre-expressão do PABP1 devido o seu envolvimento com diversas funções fisiológicas que diminuem com o envelhecimento, tais como: desenvolvimento, metabolismo, reprodução, ritmo circadiano e homeostase. Por conectar sistema neuroendócrino aos processos fisiológicos, supõe-se que o hipotálamo seja um regulador chave no envelhecimento sistemático. Foi possível observar que de uma forma geral a taxa de síntese proteica sofre realmente alterações com o envelhecimento. Os resultados obtidos apontam para um papel fundamental da PABP1 no envelhecimento ao induzir a expressão de P62. A expressão de P62 induzida por PABP1 poderá ter, potencialmente, um papel na inflamação, pois podem afetar os níveis de citocinas cruciais, levando à sua redução. Observou-se que danos celulares que geram instabilidade genómica ou condições de estresse podem afetar a taxa geral de síntese proteica, provavelmente, afetando a longevidade. Em conclusão, há uma corelação complexa entre o envelhecimento e síntese proteica. A síntese proteica pode ser alterada por danos celulares que afetam os componentes da maquinaria de tradução, como mutações que causam instabilidade genómica ou estresse oxidativo, impactando subsequentemente a longevidade. PABP1, um componente central na maquinaria de tradução, poderá ter um papel no contexto do envelhecimento por induzir a expressão de P62, que está envolvida em vários processos celulares que implicam o envelhecimento. A PABP1 também, potencialmente, poderá diminuir a inflamação no hipotálamo, indiretamente induzindo a diminuição do IL-6 através do P62, o que permite mitigar várias patologias associadas à inflamação com o envelhecimento. No entanto, devido à complexidade da relação da síntese proteica com o envelhecimento, mais estudos futuros são necessários para elucidar o papel da síntese proteica no envelhecimento.Aging is a universal biological process characterized by an accumulation of damage and other deleterious changes that lead to a progressive loss of physiological integrity, functionality, and fitness, ultimately resulting in death. It constitutes the primary risk factor for major human pathologies such as cancer, diabetes, cardiovascular disorders, and neurodegenerative diseases. It was proposed nine hallmarks of aging (genomic instability, telomere attrition, epigenetic alterations, loss of proteostasis, deregulated nutrient sensing, mitochondrial dysfunction, cellular senescence, stem cell exhaustion, and altered intercellular communication) that are considered to contribute to the aging process and cooperatively determine the aging phenotypes. Among these multiple molecular mechanisms underlying aging, alterations that affect protein synthesis seem to play a central role. Accumulating evidence suggests that protein synthesis and translation control could significantly influence lifespan. Therefore, this study aims to elucidate the role of protein synthesis and translation control in aging and lifespan and understand their functional connection with several hallmarks of aging. To this end, the translation rate profile was analyzed in different cellular models. Furthermore, to establish a link between aging and protein synthesis, we focused on polyadenylate binding protein 1 (PABP1), a central protein in the control of mRNA translation and stability. PABP1 was overexpressed in old mice's hypothalamus, and key proteins tightly linked with the hallmarks of aging were analyzed. We found that the overall rate of protein synthesis is altered with aging. Moreover, we observed that cellular damage generating genomic instability or stress conditions could impact the overall rate of protein synthesis, possibly affecting lifespan. In addition, our data point to a key role of PABP1 in aging by inducing the expression of p62. PABP1-induced expression of p62 could potentially have a role in inflammaging, as it could reduce the levels of crucial cytokines such as IL-6. Altogether, the results revealed a complex relationship between protein synthesis and aging; therefore, more studies are necessary to elucidate the role of protein synthesis in aging

From pluripotency to early events leading to cardiogenesis

Heart diseases are the leading cause of death worldwide, which includes acquired cardiovascular diseases and congenital heart diseases. The Cited2 gene is important for proper heart development and cardiac cell differentiation from pluripotent stem cells. Previous studies suggested that the role of Cited2 in cardiac differentiation could begin during the early events that occur in pluripotent cells that undergo differentiation. In mouse embryonic stem cells, Cited2 is important for self-renewal maintenance, as cells die or differentiate under Cited2-depleted conditions. In differentiation, embryonic stem cells depleted of Cited2 at the onset of differentiation show an impairment of cardiac cell differentiation. However, the mechanisms behind these observed phenotypes of Cited2-depletion are not well established. In this work, differentially expressed genes were identified in undifferentiated mouse embryonic stem cells and differentiated cells on day-4 of differentiation. Thus, using mouse embryonic stem cells that can be conditionally depleted of Cited2, after 16 hours of incubation it was observed that Cited2-depleted cells under undifferentiation conditions tend to show increased levels of the DNA damage marker γH2AX, concomitant with decreased expression of DNA repair genes (Rad51c, Rad9b, and Mdc1) and increased expression of pro-apoptotic genes (p21, Ptges, Plk2). In differentiation conditions using the hanging drop method, on day-4 of differentiation, epigenetic mark H3K27ac showed a decrease in the promoter region of cardiopoietic genes concordant with their downregulation (Brachyury, Cdx2, Dkk1, Isl1, Kdr, Mesp1, Wnt5a). However, the results of the H3K27me3 marks, showed higher variability and did not match the reciprocal marks of H3K27ac. Moreover, the increase in H3K27ac mark in undifferentiated Cited2-depleted cells corresponded, as expected, to an upregulation of the same genes. Lastly, histone acetyltransferase activity assay using the whole cell extract showed a tendency to increase acetylation in Cited2-depleted cells. In conclusion, the role of Cited2 in DNA repair and the cause of increased cell death remains to be established, while delayed expression of mesoderm/cardiac genes could be associated with misregulation of epigenetic H3K27(me3/ac) marks at the promoters of cardiopoietic genes.As doenças cardíacas são responsáveis pela maioria das mortes a nível mundial de acordo com a Organização Mundial de Saúde. Este grupo de doenças inclui as doenças congénitas cardíacas e as doenças cardiovasculares. Embora as doenças cardiovasculares possam ser mitigadas pela adoção de estilos de vida saudáveis, as doenças congénitas cardíacas não podem ser tão facilmente evitadas. Isto, porque estas doenças têm uma componente genética que leva à malformação do coração, e apesar de em alguns casos ser possível operar os recém-nascidos, ainda não há terapias génicas que resolvam a totalidade destes casos. Portanto, é assim necessário perceber melhor o desenvolvimento cardíaco e o papel que alguns genes têm neste complexo processo. Esta complexidade reflete-se na coordenação de expressão de diferentes fatores de transcrição (e.g. Brachyury, Nkx2.5, Mesp1, Isl1), e ativação de diferentes vias de sinalização (e.g. FGF, TGF, BMP, NODAL, e a WNT). Estas vias atuam em sincronia tendo um efeito de ativação ou inibição de fatores de transcrição dependendo do tecido do embrião e do estádio de desenvolvimento (ou seja, também depende do tempo decorrido). Este trabalho foca-se na compreensão dos diferentes papeis do gene Cited2 em condições de pluripotência e de diferenciação. Foi demonstrado que mutações neste gene em humanos estão associadas a doenças congénitas cardíacas. Em laboratório, a deleção deste gene em ratinho (Mus musculus) leva à sua morte in utero, principalmente por malformações do coração. Estudos em células estaminais embrionárias de ratinho mostraram que Cited2 é também importante para a manutenção da pluripotência uma vez que Cited2 promove a expressão de Nanog, que por sua vez leva à expressão de outros genes importantes para a manutenção da pluripotência. Contudo, quando Cited2 é depletado (ou seja, a expressão é diminuída), verifica-se um aumento da morte celular e da diferenciação espontânea; mesmo em células mantidas em condições de pluripotência, usando meio suplementado com LIF. Em contexto de diferenciação verificou-se, usando também células estaminais de ratinho, que a depleção de Cited2 no início do protocolo da gota suspensa levou a uma diminuição na capacidade de diferenciação cardíaca. Trabalhos anteriores do laboratório mostraram que existe um atraso na expressão de genes importantes para a especificação da mesoderme e de diferenciação cardíaca, nomeadamente: Brachyury, Mixl1 e Mesp1. Este trabalho partiu da análise de dados de “microarrays” (Affymetrix) de um trabalho anterior no laboratório, que tinha como alvo identificar os genes diferencialmente expressos entre dois grupos de células: as células controlo (com expressão de Cited2) vs as células tratadas (sem expressão de Cited2); e em duas condições experimentais: pluripotência e diferenciação. Deste modo, o trabalho foi separado em duas partes, uma dedicada ao papel do Cited2 em pluripotência e outra em diferenciação. Para compreender o papel de Cited2 na pluripotência, foram feitas experiências com células de ratinho que permitem a depleção condicional de Cited2 quando se adiciona o composto 4HT ao meio de cultura (usando como controlo etanol). Assim, após análise dos “microarrays” verificou-se que existiam alguns genes de reparação do ADN que estavam regulados negativamente (Rad51c, Rad9b e Mdc1), enquanto alguns genes que promovem a morte celular por apoptose estavam regulados positivamente (p21, Ptges, Plk2). Portanto, estes resultados sugeriram que um possível mecanismo que leva ao aumento de morte celular quando Cited2 é depletado que pode estar associado com dano do ADN. Deste modo, a quantidade de dano nas células foi avaliada por “Western Blot” e por microscopia de confocal, onde foi usado como marcador de dano no ADN a histona H2AX. Na presença de dano no ADN esta histona é fosforilada, e passa a denominar-se por γH2AX. Assim, verificou-se que apesar de existir um aumento dos níveis de γH2AX depois de 16 horas de tratamento, os resultados não foram estatisticamente significativos. Portanto, não foi possível estabelecer com certeza que a causa de morte celular devido à depleção de Cited2 é causada pelo aumento de dano no ADN. Contudo, os resultados de “microarray” sugerem que genes associados ao p53 possam estar envolvidos (referidos acima). Como perspetivas futuras é proposto que se estude a possível modelação por CITED2 da atividade do p53 através da acetilação por p300/CBP. Relativamente ao papel de Cited2 na diferenciação, a análise dos “microarrays” sugeriu que alguns genes que estavam regulados negativamente são controlados por um complexo repressor de expressão (PRC2). Portanto levantou-se a hipótese de que o atraso na expressão dos genes marcadores da mesoderme e de diferenciação cardíaca possam estar bloqueados quando Cited2 está pouco expresso. Deste modo, realizaram-se experiências de immunoprecipitação de cromatina tendo como alvo duas modificações pós-traducionais: H3K27me3 e H3K27ac. Estas modificações são recíprocas, onde a tri-metilação (me3) está associada a repressão dos genes, e a acetilação (ac) está associada a ativação de expressão dos genes. Os resultados mostraram que, de facto, embora não estatisticamente significativos, existe uma tendência para uma diminuição da marcação H3K27ac ao dia-4 de diferenciação nos promotores dos genes Brachyury, Cdx2, Dkk1, Isl1, Kdr, Mesp1 e Wtn5a. Concordante com estes resultados, e como seria de esperar, estes genes encontraram-se negativamente regulados. O inverso foi observado para as condições de pluripotência, ou seja, a baixa expressão de Cited2 levou a uma tendência para aumento de acetilação, que foi seguida pelo também esperado aumento de expressão desses mesmos genes. Contudo, a marcação de metilação mostrou ter um erro maior, e não seguia a esperada reciprocidade com os resultados da acetilação. Por fim, de modo a perceber a influência de Cited2 na capacidade de acetilação das células foi realizado um ensaio in vitro para comparar os níveis de acetilação de extratos proteicos totais de células expressando e não-expressando Cited2. Os resultados mostram que as células depletadas de Cited2 têm um aumento de acetilação. Contudo, não foi possível demonstrar que a acetilação de histonas por p300/CBP é diretamente modulado por CITED2. Em suma, este trabalho não permitiu de forma clara demonstrar que o aumento da morte e diferenciação espontânea seja causado por dano no DNA aquando da depleção de Cited2. No entanto, este trabalho propõe que o atraso da expressão de genes importantes para a diferenciação cardíaca tenha uma componente associada à desregulação de mecanismos epigenéticos, nomeadamente regulação de H3K27me3/ac

Mapping saltmarsh vertical distribution communities in southern Portugal using high spatiotemporal resolution satellite imagery

Saltmarshes, transitional coastal habitats between terrestrial and marine ecosystems, offer crucial ecological benefits, including coastal protection, biodiversity enhancement, water purification and carbon sequestration. However, saltmarsh areas are shrinking, primarily due to human activities. Traditional monitoring approaches for saltmarsh coverage are often costly and restricted in spatial scope, prompting a shift towards remote sensing techniques. While remote sensing has proven effective for studies that cover large spatial areas, its application for smaller areas remains challenging. In this study, we trained classification models to identify saltmarsh vegetation communities in southern Portugal. We utilized high-resolution (3-metre) and high-frequency (near-daily) imagery to optimize image selection according to tidal conditions at the time of capture and developed an elevation proxy for the intertidal zone. Our model achieved an overall accuracy of 67%, estimating a total of 4,572 ha of saltmarsh in southern Portugal, 85% located in the Ria Formosa lagoon. The middle saltmarsh zone, dominated by Atriplex portulacoides, Salicornia perennis and Salicornia fruticosa, covered the largest area. The approach presented here holds promise for further refinement, enabling automated, high-resolution monitoring of saltmarsh communities, which is essential for conservation and management initiatives.020.03825.CEECIND; A.BG.CALL4.012.2020; Grants FAM 2023/2024N/

Contribution of tribbles protein family members in glioblastoma cells

Glioblastoma (GBM) is the most lethal and common form of brain tumor. Currently, the standard treatment comprises surgery, radiotherapy, and chemotherapy with temozolomide (TMZ). However, its prognosis is very deficient due to acquired resistance to therapy and frequent tumor recurrence. Despite research advances, GBM remains largely incurable, with an average survival expectation of 15 months. To improve patients’ response to treatment there is an urgent need for new therapeutic strategies. Tribbles family members (TRIB1, TRIB2, and TRIB3) are pseudokinases known to regulate essential processes such as cell survival and proliferation by modulating signaling pathways. The upregulation of Tribbles has been correlated with a poor prognosis in different types of cancer, such as colorectal and breast cancer, although little is known about their role in GBM. Previous studies have linked high levels of Tribbles with the progression of different tumors. Preliminary data from our laboratory identified the correlation of high mRNA levels in GBM, resulting in a worse prognosis. Thus, we hypothesized that Tribbles proteins have a tumorigenic role in GBM. Our project focused on generating cell-based tools that allowed the modulation of Tribbles protein levels on GBM cells. Our results showed that we successfully generated knock-out (KO) GBM lines for TRIB2 and TRIB3. Assays with the generated KO lines demonstrated that inhibition of TRIB3 resulted in decreased proliferation and cell viability in GBM cells. Furthermore, the reduction of TRIB2 levels caused arrest in the mTOR signaling pathway. In general, our results lead to the understanding that Tribbles proteins contribute to the tumorigenesis of GBM cells.Os gliomas têm como origem as células da glia e são o tipo mais comum de cancro do cérebro. Segundo a Organização Mundial da Saúde, gliomas podem ser classificados em quatro graus de acordo com sua malignidade. Os gliomas de grau IV são também denominados de glioblastoma (GBM), sendo o tipo mais letal. Pacientes com GBM apresentam uma expectativa de vida de aproximadamente 15 meses, sendo que apenas entre 0,5 e 4,7% dos pacientes sobrevive após 5 anos de diagnóstico. A letalidade deste tipo de tumor pode ser em grande parte explicada devido a sua complexidade. De um ponto de vista molecular, três vias de sinalização encontram-se frequentemente alteradas neste tipo de tumor: via PI3K/AKT, via RB e via P53. Atualmente, o tratamento padrão para pacientes de GBM compreende cirurgia, radioterapia e quimioterapia com temozolomida (TMZ). No entanto, devido à sua alta complexidade, as células de GBM tornam-se invasivas e adquirem resistência à terapia. Como consequência, cerca de 90% dos pacientes sofre com o reaparecimento tumoral. Nesse sentido, é de extrema relevância a descoberta de biomarcadores que nos possibilitem uma melhora no prognóstico e a identificação de alvos terapêuticos. Estas descobertas permitiriam o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes a fim de aumentar a sobrevida dos pacientes de GBM. Os membros da família Tribbles (TRIB1, TRIB2 e TRIB3) são denominados de pseudoquinases por falta de um domínio catalítico que os permita fosforilar outras proteínas. As proteínas Tribbles estão envolvidas na regulação de processos essenciais (como proliferação, diferenciação e metabolismo celular) através da modulação de vias de sinalização, como por exemplo PI3K/AKT. Dessa forma, a desregulação dos seus níveis está associada a diferentes doenças, entre elas o cancro. Vários estudos descreveram a relação entre sobre-expressão de membros da família Tribbles e a progressão tumoral. Como exemplo, elevados níveis de expressão de TRIB2 está relacionado com pior prognóstico em melanoma, cancro do pâncreas, cancro do pulmão e leucemias. Em relação à TRIB3, altos níveis desta proteína estão associados à tumorigénese em carcinoma renal, retinoblastoma e cancro da bexiga. No entanto, ainda pouco se sabe em respeito a relação entre proteínas Tribbles e GBM. Análises preliminares de dados da expressão de mRNA em gliomas realizadas pelo estudante de doutoramento Bruno Santos indicaram que os níveis de mRNA de TRIB1/2/3 estão associados ao grau e à malignidade de gliomas. Isto é, GBMs apresentavam altos níveis de Tribbles, bem como um pior prognóstico. Em associação, esta mesma categoria apresentava também reduzidos níveis de proteínas FOXOs. Levando em consideração esses dados e o papel tumorigénico das proteínas Tribbles em outros tipos de cancro, nossa hipótese é que os membros de Tribbles contribuem para a progressão tumoral de GBM. Portanto, nos propusemos a gerar linhas celulares com níveis de expressão de Tribbles modulados a fim de estudar o papel dos membros dessa família na biologia do GBM. Conseguimos atingir com sucesso nosso objetivo principal de criar ferramentas que nos permitiriam estudar o efeito da modulação das proteínas Tribbles em GBM. Através da tecnologia CRISPR/Cas9, a partir de linhas celulares de GBM, geramos uma linha knock-out (KO) para TRIB3 (U-118 TRIB3 KO) e uma linha KO para TRIB2 (LN-229 TRIB2 KO). Durante este projeto, estudos realizados com a linha U-118 TRIB3 KO demonstraram que a inibição de TRIB3 nessas células levou a uma redução na viabilidade celular. Ainda, nossos resultados indicam que a redução da viabilidade associada ao TRIB3 ocorre devido a diminuição da proliferação celular, e não de um aumento de morte celular. Em relação ao status das vias de sinalização que poderiam estar a resultar no fenótipo observado, não observamos diferenças na regulação da via de sinalização AKT/mTOR e de MAPK/ERK após redução de TRIB3. Somado a estes dados, também analisamos o comportamento celular após 72h de exposição ao tratamento com TMZ. Demonstramos que, apesar das células com inibição de TRIB3 não apresentarem aumento à sensibilidade ao tratamento com TMZ, devido à diminuição da viabilidade celular causada em níveis basais, pacientes com baixos níveis de TRIB3 poderiam ser mais beneficiados à terapêutica com TMZ. Em relação as células KO para TRIB2, devido à falta de tempo, não nos foi possível realizar estudos para avaliar fenotipicamente o efeito da inibição de TRIB2 em células de GBM. No entanto, resultados preliminares da caracterização de níveis de proteínas nessas células demonstrou que a redução de TRIB2 foi capaz de inibir a via mTOR. Entretanto, ainda é preciso aumentar a replicabilidade do experimento e analisar outros parâmetros a fim de podermos confirmar um papel tumorigénico de TRIB2 em GBM. Em resumo, nossos resultados dão-nos indícios que os membros da família de proteínas Tribbles contribuem para a progressão tumoral em GBM. A identificação de biomarcadores e alvos farmacológicos no contexto de GBM é de extrema importância para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que melhorem o prognóstico deste tipo de cancro ainda tão letal. Assim, a geração de ferramentas que possam ajudar a possivelmente identificar a família de proteínas Tribbles como oncogenes em GBM confere um caráter relevante a este projeto

Effects of high-pressure processing (HPP) on the structure and potential of allergenicity of β-Parvalbumin from the European sea bass (Dicentrarchus Labrax)

Fish allergy is an adverse immune response which affects 3% of the world population and is currently without cure. Parvalbumin (PARV) is the major allergen of fish allergies, eliciting IgE-mediated immune responses. It is a conserved protein in finfish species and highly abundant in the muscle, the largest portion of the food in fish. Two main PARV family clusters have the designations α and β, but only the β is a proven allergen. -PARV is considered a pan-allergen because as it has a vital function, it is widely distributed in wide range of bony fish species and other animals. Attempts to neutralize the allergenicity of proteins in food have been taken, by testing innovative processing methods, such as the High Hydrostatic Pressure (HP). An eco-friendly technology able to preserve the freshness and nutritional benefits of food products, while prolonging their shelf-life. Although HP processing of fish has a relatively small effect on sensory parameters, evidence shows modifications in the proteome and protein solubility of HP treated sea bass (Dicentrarchus labrax, dl) fillets, but the potential influences on human health, regarding the allergenicity is poorly clarified. In this thesis, the effect of HP and/or storage time in the allergenicity potential of -PARV from sea bass fillets was investigated. -PARV was successfully purified from the sarcoplasmic protein fractions of HP (600Mpa and 5 min.) and control fish after isothermal storage for 1 and 11 days and was analyzed by biochemical and biophysical techniques and in silico analysis to predict potential changes in the structural conformation. The results show a prevalence of α-helix in dl-PARV isolated from unprocessed fish fillets and those exposed to HP and time of storage modified the secondary and tertiary protein structure. dl-PARV epitope reactive to IgE/IgE shared a significant portion of residues in a position predicted to be of α-helix. The results suggest that the structural changes caused by HP may alter the allergenicity potential of dl-PARV, since the allergenic epitope seems to depend on protein conformation.O peixe é um dos recursos marinhos mais valiosos, sendo um factor vital para o crescimento económico e social de diversas nações e populações. A inclusão de peixe fresco num estilo de vida saudável é apoiada por diversos autores, principalmente porque são ricos em proteína. No entanto, a alergia ao peixe é uma resposta imune adversa, actualmente sem cura, cuja prevalência é cerca de 3% da população mundial, segundo dados da Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura. A parvalbumina (PARV) é o maior alérgeno em peixes, provocando respostas imunes mediadas por IgE e é abundante no músculo branco de muitos vertebrados. Existem dois grupos principais da família das PARV´s, α e β, mas apenas a β é comprovadamente alergénica. A β-PARV é uma proteína acídica, de 10 a 15 kDa e tem 3 domínios EF-hand, 2 dos quais ligam Ca2+, factor importante na conformação dos epítopos IgE. Apesar de existirem diferentes isoformas em peixes, a sua estrutura tridimensional é bastante conservada, potenciando a reactividade cruzada por IgE. É considerada um pan-alérgeno porque como tem uma função vital, é amplamente distribuída numa ampla gama de espécies de peixes e outros animais. O peixe fresco é um produto muito sensível e altamente perecível, contribuindo para grande parte do desperdício alimentar. Métodos inovadores de processamento (ex: ultra-som ou plasma frio) estão a ser testados de modo a terem um papel crucial no rendimento da produtividade dos actuais sistemas alimentares, especialmente na indústria de pescado. A Alta Pressão Hidrostática (APH), é uma tecnologia não-térmica, inovadora e ecológica, que se mostra muito atractiva para a indústria alimentar, dado que, a pressão inactiva microrganismos e metabolitos reesposáveis pela rápida degradação dos alimentos. O prolongamento do prazo de validade de peixe processado por APH já foi reportada em diferentes espécies, podendo triplicar o prazo de validade. Além disso, a APH é capaz de preservar a frescura e os benefícios nutricionais do pescado. Estas novas tecnologias de processamento, incluindo a APH, têm também sido utilizadas como tentativas de neutralizar a alerginicidade das proteínas nos alimentos, mas o seu real impacto e consequências ainda não são muito claros. Uma delas é o facto de a pressão poder ser uma força desestabilizadora da estrutura e estabilidade das proteínas. As alergias a peixes ocorrem quando os anticorpos IgE se ligam aos epítopos no alérgeno do peixe ingerido, e o nível de exposição dos epítopos é influenciado pela conformação tridimensional da proteína. Tem sido reportado que o processamento por APH é capaz de produzir eventos como a destruição de epítopos, formação de novos epítopos e neo-alérgenos ou mudanças conformacionais que mascaram ou expõem epítopos às enzimas gastrointestinais. O efeito da APH na β-PARV dos peixes tem sido reportado em diferentes espécies (como a corvina grande amarela Larimichthys crocea, a carpa prussiana Carassius gibelio ou o bacalhau-do-atlântico Gadus morhua) e apesar de se verificar alteração da estrutura do alergénio, esta parece ser no sentido de reduzir a sua alerginicidade, sustentando a relevância deste método na qualidade e segurança alimentar. No entanto, é de notar que este efeito pode não ser característico em todas as espécies de peixe ou não ser transversal a todos os pacientes alérgicos a peixe. Embora o processamento por APH tenha um efeito ténue nos parâmetros sensoriais e permita uma extensão da validade, estudos prévios mostraram modificação na solubilidade proteica e no proteoma total em filetes de robalo (Dicentrarchus labrax, dl) processados, mas o possível impacto no potencial de alerginicidade desta espécie de peixe é pouco conhecido. Esta tese teve como principal objectivo, investigar o efeito do APH e/ou tempo de armazenamento no potencial de alerginicidade da proteína β-PARV de filetes de robalo. A β-PARV foi purificada de extractos proteicos da fracção sarcoplasmática do musculo branco de filetes de robalo, previamente processados (por AHP, 600 MPa durante 5 min.) e não processados (controlo, C) e armazenados isotermicamente durante 1 e 11 dias. Para atingir o objectivo, aplicou-se um conjunto de técnicas bioquímicas e biofísicas associadas à análise de proteínas [electroforese em gel poliacrilamida (SDS-PAGE/Nativo/2-DE), purificação por electroforese de eluição continua, Western blot, espectroscopia de massa (MALDI-TOF/MS), espectroscopia (fluorescência e dicroísmo circular-CD)] e também análises in silico de pesquisa de sequências, alinhamentos, previsão de características bioquímicas e biofísicas, bem como de previsão de estruturas de proteínas. Os resultados indicam que o processamento por APH, mais do que o tempo de armazenamento, modificou o perfil do proteoma total e a solubilidade proteica da fracção sarcoplasmática do musculo do filete de robalo em comparação com o controlo. Proteínas de menor peso molecular surgem em maior diversidade após tratamento e proteínas de maior dimensão sofrem uma diminuição considerável. O anticorpo monoclonal anti-Parv19, reconhece a dlβ-PARV (algo nunca publicado até hoje). com o peso molecular esperado de 12kDa, independente da pressão ou tempo de armazenamento usado. A purificação da dlβ-PARV a partir dos extractos das diferentes condições experimentais testadas (C1, C11, APH1, APH11) foi bem-sucedida, e o 2-DE revelou a existência vários spots, sugerindo que múltiplas isoformas existem ou modificações pós tradução ocorrem na proteína. As análises estruturais confirmaram a presença de estrutura terciária e secundária (maioritariamente de α-helix) na β-PARV não processada (C1). A remoção de cálcio da parvalbumina não aparenta afectar a reactividade com o anticorpo PARV-19 tanto com amostras controlo como em amostras processadas. O tratamento por AHP conduz á perda de estrutura secundária e terciária (APH1) sendo este efeito revertido durante o armazenamento (APH11), sugerindo que a alteração é reversível. Dado que o epítopo alergénico é de natureza conformacional, os resultados sugerem uma potencial recuperação da estrutura do epítopo e especulamos uma possível manutenção do índice de alerginicidade. Contudo, estudos adicionais serão necessários (ex, aplicação in vivo e/ou in vitro em linha celulares, ensaios de digestibilidade, etc.) para inferir sobre o real efeito no potencial de alerginicidade da dlβ-PARV sob as condições testadas. Em resumo, o processamento por APH e o tempo de armazenamento (nas condições testadas) são dois factores que afectam as proteínas do músculo do robalo, mais concretamente a dlβ-PARV e poderão reflectir alterações na sua alerginicidade, mas são necessários mais estudos para confirmar esta relação.Este trabalho foi realizado no âmbito de dois projetos (SEAFOODQual/ICHTHYS

Evaluation of high-pressure processing (HPP) in european seabass (Dicentrarchus labrax) allergenicity

Despite fresh fish being a valuable source of essential nutrients in the human diet, they are highly perishable compared to other food sources and they are among the major allergenic food products. It has been estimated that allergies provoked by fish proteins are on the rise (up to 0.9% of the USA adult population is affected). Moreover, novel food processing technologies, such as High-Pressure processing (HPP), are being implemented as a means to extend the shelf-life of perishable food and reduce waste, but their impact on food allergenicity is not well known. Allergens are often proteins found in common foods, and food processing may lead to the exposure or loss of IgE epitopes, potentially increasing or decreasing the allergenic potential, respectively. Around 12 important allergenic proteins in different fish species (seabass is not reported) have been identified and registered in 2023 in the WHO/IUIS allergen nomenclature sub-committee database but few studies have explored how they change under processing conditions. This study explored the effect of HPP (300, 450, 600 MPa for 2 and 5 min, 1 and 12 days of refrigerated storage) on the allergens present in the soluble sarcoplasmic fraction of white muscle from European seabass (Dicentrarchus labrax), one of the most consumed species in the Mediterranean. Proteome analysis showed a significant decrease in protein solubility (p < 0.05), and alteration in the proteome profile between control and processed samples, in a pressure-dependent manner. Four sarcoplasmic proteins were tested by Western blot as promising biomarkers of fish that has undergone HPP (allergenic proteins and/or processing biomarkers), three of them (FBP2, Aldolase A, Tropomyosin, (p < 0.05)) were sensitive to pressure intensity. The allergenicity of unpressurized seabass was investigated by Western blot using human blood serum or plasma from patients with fish allergies (n = 16) or non-allergic controls (n = 3), resulting in the detection of 9 IgE immunoreactive protein bands in seabass extracts. Although 7 individual IgE reactive protein bands changed after HP processing, the total detectability and thus the total allergenicity of the processed fish was not significantly affected by HPP. Finally, two isoforms of a major fish allergen, β-parvalbumin, were successfully been purified from seabass in their native forms. These isoforms exhibited divergent IgE reactivity and were both affected by HPP (p < 0.05). In summary, our results strongly contribute to characterise seabass allergic potential so it can be registered in the public database listing allergenic fishes. Furthermore, although HPP changed the muscle proteome it did not dramatically change the intrinsic allergenicity, as measured by IgE immunoreactivity, of the European seabass fillets.Apesar do peixe fresco ser uma fonte valiosa de nutrientes essenciais na dieta humana, este alimento é altamente perecível em comparação com outras fontes alimentares. Além disso, está entre os principais produtos alimentares considerados alergénicos e estima-se que as alergias alimentares provocadas pelas proteínas do peixe estão a aumentar (até 0,9% da população adulta dos EUA está a ser afetada). Novas tecnologias de processamento de alimentos, como o processamento por alta pressão (High pressure processing, HPP), estão a ser implementadas como um meio de prolongar a vida útil destes alimentos perecíveis e reduzir o desperdício alimentar, mas o seu impacto real na alergenicidade alimentar não é ainda bem conhecido. Os alergénios são frequentemente proteínas comuns nos alimentos e o processamento pode levar à exposição ou ocultação de epítopos de IgE (imunoglobulina E), que podem aumentar ou diminuir o potencial alergénico do alimento. Cerca de 12 proteínas alergénicas identificadas em diferentes espécies de peixes (não reportado em robalo, Dicentrarchus labrax) estão registadas na base de dados do subcomité de nomenclatura de alergénios da OMS/IUIS (até 2023), mas poucos estudos têm explorado o impacto das novas tecnologias de processamento nos alergénios e menos se têm reportado ao robalo. Este estudo explorou o efeito do HPP (300, 450, 600 MPa por 2 e 5 min. e armazenamento refrigerado durante 1 e 12 dias) sobre os alérgenos presentes na fração sarcoplasmática solúvel do músculo branco e filetes de robalo europeu (Dicentrarchus labrax), uma das espécies de peixe mais consumida na região Mediterrânica. A análise da solubilidade e do perfil do proteoma revelou uma diminuição significativa da solubilidade proteica (p < 0,05) e alteração no perfil do proteoma entre amostras controlo e processadas por HP, de maneira dependente da intensidade da pressão. Quatro proteínas sarcoplasmáticas foram testadas por Western blot como biomarcadores de processamento por HP (proteínas alergénicas e/ou biomarcadores de processamento) e três delas FBP2, Aldolase A, Tropomiosina mostraram ser sensíveis à intensidade de pressão (p < 0,05). A alergenicidade ao robalo não pressurizado foi investigada por Western blot utilizando soro e plasma humano de pacientes alérgicos a peixes (n=16) ou não (n=3), resultando na deteção de 9 bandas de proteínas imunorreativas a IgE. Embora 7 bandas individuais de proteínas reativas à IgE tenham apresentado alterações na detetabilidade após o processamento por HP, a alergenicidade total ao produto não foi significativamente afetada pelo processamento. Duas isoformas do principal alérgeno de peixes, a β-parvalbumina (β-Parv), foram purificadas com sucesso e na forma nativa a partir da fração sarcoplasmática do músculo branco de filetes de robalo e demonstraram reatividade diferencial para a IgE (p < 0.05). Em resumo, os nossos resultados contribuem fortemente para colocar o robalo na lista da base de dados pública de peixes com potencial de alergenicidade e, apesar do efeito das alterações no proteoma, o processamento por HP parece não alterar a alergenicidade intrínseca dos filetes de robalo europeu

Generation of a novel Cockayne syndrome B neuronal culture model from patient-derived induced pluripotent stem cells

Cockayne syndrome type B (CSB) is a rare genetic, multisystem disorder, which results from accumulation of DNA damage that arises when the associated gene, ERCC6, is dysfunctional. This leads to premature aging and neurodegeneration. Studies on CSB pathophysiology are lacking, and pre-clinical research of potential therapeutic strategies is nonexistent. Patients with CSB are left without any chance of disease cure or delay, experiencing premature death. Patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) offer a powerful tool to investigate disease mechanisms while generating possibilities for treatment. As a result, our goal was to generate iPSCs from the fibroblasts of CSB patient, as an in vitro model, and differentiate them into neural cell cultures that exhibit CSB-related neuropathological alterations. To achieve this goal, human patient fibroblasts were reprogramed into CSB-iPSCs with the CytoTune iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit. CSB-iPSCs and fibroblasts genetic profile analysis confirmed relatedness between cell lines. The ERCC6 gene was sequenced demonstrating to have the expected mutation, and Western blot analysis further confirmed the presence of a pathogenic mutation. PCR showed that CSB-iPSCs are free of reprograming virus at passage 10 and cultured cells did not contain mycoplasma contamination. Through immunohistochemistry and flow cytometry, CSB-iPSCs demonstrated to express pluripotency markers and capacity to differentiate into the three germ layers. CSB fibroblasts displayed an accumulation of dysfunctional mitochondria, and their DNA repair capacity was affected, upon UV light exposure, as observed through flow cytometry and immunocytochemistry, respectively. This suggests that CSB cells have a dysfunctional transcription-coupled nucleotide excision repair (TC-NER) and mtDNA repair. CSB-iPSCs were successfully differentiated into neurons and CSB-Neurons appeared to have longer neuronal prolongations that neurons derived from a healthy donor, indicating premature maturation. Our study suggests that the in vitro CSB model generated can help understand this disorder and contribute to the pre-clinical testing of disease-modifying therapies.As síndromes progeroides humanas são um conjunto de doenças genéticas raras caracterizadas pelo envelhecimento precoce. Embora a compreensão das causas subjacentes a algumas destas doenças tenha sido benéfica no desenvolvimento de terapias, isso não é válido para todas estas condições. A síndrome de Cockayne tipo B (CSB) é uma doença rara, multisistémica, com hereditariedade autossómica recessiva, que resulta do acumular de danos no ADN que surgem quando o gene associado, ERCC6, está disfuncional. Isto acaba por induzir envelhecimento precoce e neurodegeneração. Para além disto, os sintomas desta doença incluem microcefalia pós-natal, atraso severo do crescimento, hipersensibilidade à luz ultravioleta (UV), anormalidades músculo-esqueléticas, deterioração dentário, perda de audição e problemas oculares. No entanto, pneumonia, outras complicações respiratórias e falha renal são as causas mais comuns de morte nestes doentes. Existem três tipos diferentes de síndrome de Cockayne (CS), nomeadamente: (i) tipo I (CS I), a forma clássica, em que os sintomas se manifestam nos primeiros dois anos de vida dos doentes, que têm uma esperança média de vida de 16 anos; (ii) tipo II (CS II), a forma mais severa, com um fenótipo caracterizado por se manifestar antes do nascimento, esperança média de vida muito curta (5/6 anos) e problemas neurológicos severos; e (iii) tipo III (CS III), correspondente a um fenótipo moderado, em que os doentes possuem uma esperança média de vida de 30 anos. Os doentes com mutações no gene ERCC6 normalmente estão mais associados a CS II. Estudos sobre a fisiopatologia de CSB são notavelmente escassos, e investigação pré-clínica de possíveis estratégias terapêuticas é virtualmente inexistente. Os doentes com CSB ficam, assim, sem qualquer hipótese de cura ou atraso da doença, sofrendo uma morte prematura entre os 5 e os 30 anos