Production d'une protéine membranaire humaine par cultures en réacteurs de cellules animales recombinantes : obtention de la lignée CHO recombinante et études cinétiques en réacteurs discontinus et semi-continus

Abstract

Not availableL'objectif général de ce travail est l'étude de la production d'une enzyme membranaire humaine à intérêt clinique (la gamma glutamyltransérase: GGT) par cultures en réacteurs de cellules animales CHO (Chinese Hamster Ovary) recombinantes. La première partie concerne l'obtention de la cellule CHO recombinante. Pour cela, la mise au point d'une technique de transfection par electroporation a été réalisée et évaluée par un test de permeébilisation membranaire, puis la stabilité de la production GGT par ces cellules recombinantes a été vérifiée pendant 18 passages. Les caractéristiques structurales et catalytiques de l'enzyme recombinante ont été déterminées et montrent l'obtention d'une enzyme active avec un taux d'expression très performant de 2U/mg de protéines. Les cinétiques de cultures en réacteur discontinu des cellules r-CHO n'ont pas montré de différences significatives dans leur comportement de prolifération, ni dans leur métabolisme de base par rapport aux cellules sauvages. La seconde partie traite de l'influence de l'adhérence cellulaire sur le comportement des cellules r-CHO en réacteur. Trois systèmes de culture ont été mis en œuvre: sur microporteurs, en agrégats ou en cellules individualisées. Il a été observé une vitesse spécifique de croissance deux fois plus élevée pour les cultures cultivées sur microporteurs; de plus, les cellules perdent leur capacité de synthèse de l'enzyme (d'un facteur 7) des qu'elles se trouvent en absence de support. Enfin, la mise en œuvre de réacteur semi-continu a permis de maintenir des concentrations cellulaires maximales pendant une période plus longue, facilitant ainsi la récupération de l'enzyme. En troisième partie, l'optimisation de la production de GGT a été envisagée, notamment par ajout d'un agent chimique inducteur. L'addition de butyrate de sodium dans une culture en réacteur semi-continu avec des cellules r-CHO sur microporteurs a permis de stimuler la production d'un facteur 1,5. L'extraction de l'enzyme membranaire est également présenté