Transporteur mitochondrial d'ADP/ATP : étude par échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse et caractérisation de mutations pathogènes

Abstract

Le transporteur d'ADP/ATP est une protéine de la membrane interne mitochondriale qui joue un rôle physiologique majeur en catalysant l'échange d'un ADP cytoplasmique contre un ATP néo-synthétisé dans la matrice mitochondriale. Cette protéine peut être inhibée de manière très spécifique par deux poisons naturels, le carboxyatractyloside (CATR) et l'acide bongkrekique (BA) qui stabilisent la protéine dans deux états conformationnels distincts adoptés au cours du mécanisme de transport. Afin de mieux appréhender cette dynamique fonctionnelle, une étude du transporteur d'ADP/ATP bovin en complexe avec le CATR ou le BA dans le détergent Triton X-100 a été réalisée par échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse. Ces travaux se sont déroulés en 4 parties. La première a consisté à adapter cette technique à l'étude des protéines membranaires intégrales. En effet, la présence de détergents, nécessaires au maintien en solution de l'état natif de ces protéines, n'a pas permis jusqu'ici de les étudier par cette approche. Pour pallier cette difficulté, un protocole automatisé de chromatographie liquide permettant l'élimination du Triton X-100 a été mis au point. Les cinétiques de deutération des différents complexes ont alors pu être analysées dans le deuxième volet de cette étude. Les données obtenues ont permis de proposer des modèles conformationnels du transport de nucléotides à travers la membrane interne mitochondriale, dans lesquels le transporteur présenterait une cavité ouverte tour à tour vers l'espace intermembranaire et vers la matrice. Afin d'apporter d'autres éléments de réponse sur ce mécanisme de transport et de s'affranchir de différents problèmes liés à l'utilisation des détergents, des essais de deutération du transporteur d'ADP/ATP bovin dans les mitochondries ont été entrepris et représentent le troisième volet de ces travaux. Cette approche, qui nécessite encore plusieurs améliorations, a permis d'obtenir les premières données de deutération d'une protéine membranaire dans son environnement natif. Le transporteur d'ADP/ATP est aussi impliqué dans des pathologies humaines plus ou moins graves. Dans une dernière partie, l'étude de ces mutations a été abordée en réalisant chez la levure Saccharomyces cerevisiae une étude phénotypique et biochimique de plusieurs mutants du transporteur de l'amibe Dictyostelium discoideum correspondant aux mutations humaines. Cette étude a mis en évidence un problème dans le mécanisme intrinsèque de transport, induit par la mutation V291M, qui pourrait être à l'origine de la pathologie associée