Identyfikacja składników proteomu jądra komórkowego Arabidopsis thaliana i analiza modyfikacji potranslacyjnych histonu H1

Abstract

Jądro jest jedną z najważniejszych, a zarazem, z powodu wyjątkowej złożoności, najsłabiej poznanych organelli komórki. Proteom jądra jest wysoce dynamiczny i, ze względu na liczne połączenia z cytoplazmą i stałą wymianę białek pomiędzy organellami, trudny do zdefiniowania. W literaturze brak kompleksowych badań proteomicznych jądra komórek roślinnych, w szczególności Arabidopsis, najważniejszego organizmu modelowego w biologii roślin. Przedstawione tu badania są pierwszą tego rodzaju analizą proteomu jądrowego Arabidopsis. Jądra użyte do analiz izolowano z zawiesinowej kultury komórek T-87 w sześciu powtórzeniach biologicznych za pomocą opracowanej w tym celu metody. Zastosowano podejście ‘shotgun proteomics’ polegające na trawieniu całego proteomu i późniejszej analizie mieszaniny peptydów za pomocą układu HPLC połączonego ze spektrometrem mas. Użycie spektrometru mas Orbitrap Velos pozwoliło na zastosowanie strategii ‘high‑high’, w której zarówno pomiary widm MS, jak i MS/MS przeprowadzano z wysoką rozdzielczością. Łącznie wykryto 6 753 białka jądrowe, będące produktami 4 862 genów. Dla prezentacji wyników doświadczeń utworzono stronę www działającą w oparciu o bazę danych pozwalającą na zmianę kryteriów identyfikacji białek. Aby stworzyć grupę odniesienia, przeanalizowano całościowy proteom komórek T‑87, co pozwoliło na identyfikację 6 342 białek, produktów 4 406 genów. Połowę z białek zidentyfikowanych w preparatach jądra komórkowego znaleziono w preparatach całych komórek. Wśród białek tych znajdowały się liczne białka typowe dla jądra, co sugeruje duży udział proteomu jądra w proteomie badanych komórek. Analizy „Gene Ontology” wykazały zasadnicze różnice klas białek wzbogaconych w obu badanych preparatach. Modyfikacje potranslacyjne histonów, jednego z głównych składników proteomu jądra komórkowego, są kluczowe dla mechanizmów regulacji ekspresji genów. Modyfikacje histonów rdzeniowych są intensywnie badane. Histon H1 jest białkiem znacznie słabiej poznanym, jego funkcja nie została do tej pory wyjaśniona. Wykonanie badań H1 Arabidopsis wymagało opracowania metody jego izolacji i rozdziału za pomocą HPLC, co doprowadziło do odkrycia, że stężenie nieallelicznego wariantu H1.2 jest 13‑to krotnie wyższe niż drugiego wariantu H1.1. Do tej pory przyjmowano, że stężenia H1.1 i H1.2 są zbliżone. Stwierdzono także występowanie mniejszego, nie wykrytego dotychczas produktu alternatywnego składania transkryptu H1.2. Modyfikacje potranslacyjne roślinnego histonu H1 nie były dotychczas badane. Przeprowadzone w niniejszej pracy analizy doprowadziły do wykrycia po raz pierwszy licznych modyfikacji potranslacyjnych takich, jak fosforylacja, acetylacja, krotonylacja, formylacja, mono- i di-metylacja oraz propionylacja. Dodatkowo, stwierdzono występowanie szeregu nieznanych modyfikacji oraz przyłączenia kationu żelaza II do N-końcowej domeny H1