Herein, the environmentally friendly synthesis of the earlier unknown phospholipid analog of kinetin riboside was carried out using phospholipase D of Streptomyces netropsis. Kinetin riboside and soybean lecithin served as substrates. A maximum degree of nucleoside conversion to 5′-phosphatidyl derivative of kinetin riboside at 37°С to 6 h exceeds 95%. The structure of target product was confirmed by UV and 1Н NMR spectroscopy.С помощью фосфолипазы D Streptomyces netropsis проведен экологически безопасный синтез ранее неизвестного фосфолипидного аналога кинетинрибозида. В качестве субстратов были использованы кинетин и соевый лецитин. Максимальная степень трансформации нуклеозида в 5′-фосфатидильного производного кинетинрибозид при 37 °С за 6 ч реакции превышала 95 %. Структура целевого продукта доказана УФ- и 1Н ЯМР-спектроскопией

A. RYMKO N.

A. VASILKEVICH I.

A. ZINCHENKO I.

L. EROSHEVSKAYA A.

M. KISEL A.

А. ВАСИЛЬКЕВИЧ И.

А. ЗИНЧЕНКО И.

А. РЫМКО Н.

Л. ЕРОШЕВСКАЯ А.

М. КИСЕЛЬ А.

Russian

A. I. VASILKEVICH

M. A. KISEL

L. A. EROSHEVSKAYA

A. N. RYMKO

A. I. ZINCHENKO

А. И. ВАСИЛЬКЕВИЧ

М. А. КИСЕЛЬ

Л. А. ЕРОШЕВСКАЯ

А. Н. РЫМКО

А. И. ЗИНЧЕНКО

Reports of the National Academy of Sciences of Belarus

77Доклады Национальной академии наук Беларуси2014 март–апрель Том 58 № 2УДК 547.95:579.66А. И. ВАСИЛЬКЕВИЧ1, М. А. КИСЕЛЬ1, Л. А. ЕРОШЕВСКАЯ2, А. Н. РЫМКО,2  член-корреспондент А. И. ЗИНЧЕНКО2СИНТЕЗ ФОСФАТИДИЛЬНОГО ПРОИЗВОДНОГО КИНЕТИНРИБОЗИДА  С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФОСФОЛИПАЗЫ D STREPTOMYCES NETROPSIS1Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск 2Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск  Поступило 11.12.2013Введение. Известно, что противовирусные и противоопухолевые препараты на основе моди-фицированных нуклеозидов имеют ряд недостатков . Прежде всего, в некоторых клетках-мише-нях отсутствуют нуклеозидкиназы, способные эффективно осуществлять начальный этап мета-болической активации таких нуклеозидов [1] . Более того, многие нуклеозиды плохо проникают в клетки и поэтому большая часть их выводится из организма в неизмененном виде . Отсюда, поиск препаратов, способных с большей эффективностью проходить сквозь клеточную мембра-ну, является актуальной задачей [2] .Из теоретических соображений, 5′-монофосфатные производные модифицированных нукле-озидов являются более перспективными фармакологическими субстанциями, чем исходные ну-клеозиды . Этот вывод основан на том, что у нуклеозидмонофосфатов короче цепь метаболиче-ской активации и они активны даже в клетках, в которых отсутствуют нуклеозидкиназы . Однако нуклеозидмонофосфаты, являясь заряженными молекулами, плохо проникают через гидрофоб-ную клеточную мембрану .Одним из простых и эффективных подходов к решению проблемы транспорта лекарствен-ных нуклеозидов через гидрофобные липидные биологические мембраны в клетку является хи-мическая модификация нуклеозидов остатками жирных кислот или фосфолипидами [1; 3–8] . Та-кие коньюгаты содержат фосфатидильный остаток в качестве нетоксичной транспортной груп-пы, которая защищает нуклеозид от инактивации ферментами и, обладая высокой аффинностью к клеточным мембранам, облегчает проникновение лекарства в пораженные клетки . В клетках происходит постепенное освобождение нуклеозида, причем в ряде случаев уже в 5′-монофосфо-рилированной форме, что укорачивает цепь трансформации нуклеозида в действующее соедине-ние – нуклеозид-5′-трифосфат . Как упоминалось выше, последнее обстоятельство имеет решаю-щее значение для тех систем, где отсутствуют соответствующие нуклеозидкиназы .Одним из модифицированных нуклеозидов, который сравнительно недавно предложено ис-пользовать в качестве высокоэффективного противоопухолевого средства, является рибозид фи-тогормона кинетина . Кинетинрибозид проявляет цитотоксическую активность в культуре клеток мышей, челове-ка и опухолей растений [9] . Его антипролиферативные и апоптозные эффекты на опухолевых клетках человека также надежно документированы [10] . Цитотоксические эффекты кинетинри-бозида обусловлены его способностью вызывать быстрое истощение АТФ, приводя к генотокси-ческому стрессу, который активирует ген CDKN1A и другие ответственные за стресс гены [11] . Недавно было показано, что кинетинрибозид проявляет терапевтическую эффективность в от-ношении острого миелобластного лейкоза [12] и антипролиферативную активность на клетках рака прямой кишки [13] . Таким образом, кинетинрибозид играет важную роль при индукции клеточной гибели у клеток различных типов опухолей и может рассматриваться в качестве пер-спективного кандидата на статус противоопухолевого средства . Ранее [5; 6] нами для получения 78фосфолипидных аналогов нуклеозидов был применен вместо трудоемкого химического синтеза [7; 8] ферментативный способ, который заключается в переносе фосфатидильного остатка с фос-фатидилхолина на первичную гидроксильную группу рибозы под действием микробной фосфо-липазы D (КФ 3 .1 .4 .4) .Цель исследования – синтез фосфатидил-N6-фурфуриладенозина (ФФА) из кинетинрибозида и фосфатидилхолина с помощью микробной фосфолипазы D . Материалы и методы исследования . В качестве фосфолипидного субстрата использовали фосфатидилхолин, выделенный из препарата соевого лецитина Epicuron-200 фирмы Lucas Meyer (Германия) с помощью флэш-хроматографии на силикагеле . Процедура получения препарата фосфолипазы D Streptomyces netropsis описана нами в [5] . Использованный в работе кинетинри-бозид синтезировали методом ферментативного трансгликозилирования, как было описано ра-нее [14] . Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках Silufol-UV254 (Serva, Герма-ния) в системах растворителей хлороформ–метанол–14 н . NH4OH (14 : 4 : 0,15, система 1) и хло-роформ–метанол–7 н . NH4OH (13 : 5 : 1, система 2) . Обнаружение веществ на хроматограммах определяли по флуоресценции пятен при УФ-освещении и с помощью специфического реагента на фосфолипиды [15], а также проявлением 10 %-ным раствором H2SO4 в метаноле с последую-щим нагреванием пластинки до 200 °С . Содержание фосфора в образцах определяли по методу, предложенному в [15] . Спектры поглощения записывали на регистрирующем спектрофотометре UV-1202 фирмы Shimadzu (Япония) . Спектры ПМР регистрировали на приборе �vance 500 (Bruker, Германия) . Химические сдвиги приведены относительно тетраметилсилана как внутреннего стандарта . Результаты и их обсуждение. На первом этапе работы был проведен анализ состава и струк-туры продуктов, образующихся в ходе изучаемого ферментативного процесса . На рисунке пред-ставлена хроматограмма реакционной смеси, из которой видно, что ферментативный процесс сопровождается накоплением нового продукта . Его фосфолипидная природа подтверждается окрашиванием пятна при обработке хроматограммы специфическим реагентом на фосфолипи-79ды [15] . В спектре поглощения продукта после его выделения с помощью флэш-хроматографии наблюдается полоса погло-щения при 268 нм (этанол), характерная для гетероцикличе-ского основания (кинетинрибозида) . Соотношение содержа-ния фосфора и хромофора в образующемся фосфолипиде со-ставляет 1 : 1 .Проведенные эксперименты по определению условий ре-акции трансфосфатидилирования позволили предложить следующую методику синтеза ФФА . Реакционную смесь (14,4 мл), содержащую 50 мг (3,6 ммоль) кинетинрибозида, 9,65 мл хлороформа, 1,152 мл 2,5 М Na-ацетатного буфера (рН 6,0), 350 мг фосфатидилхолина, 0,72 мл 2 М CaCl2 и 2,8 мл фильтрата культуральной жидкости, содержащего фосфолипазу D, перемешивали при 37 °С в течение 18 ч . Вы-ход реакции синтеза ФФА составил >95 мол . % . Целевой про-дукт из конечной реакционной смеси выделяли, используя методику, описанную в [5], с последующей очисткой с помо-щью флэш-хроматографии . Структура целевого продукта доказана на основании ана-лиза данных ТСХ (рисунок), УФ-спектроскопии (λ = 268 нм) и спектров 1Н ЯМР в дейтерохлороформе в присутствии те-траметилсилана в качестве внутреннего стандарта . На хроматограмме наблюдается только один фосфолипидный продукт, что указывает на фосфатидилирование кинетинрибозида по первич-ной гидроксильной группе . Дополнительным доказательством этого факта является спектр 1Н ЯМР, в котором наблюдается сдвиг сигнала протонов H5′ в слабое поле на 0,3 м . д . по сравнению со спектром кинетинрибозида . В спектре ЯМР также присутствуют сигналы, характерные для фосфатидильной группы (протоны метильных групп жирных кислот, протоны глицеринового остатка) и групп, соответствующих протонам кинетинрибозида, в соотношении, эквивалентном их наличию в разных группах молекулы . Ниже приводятся данные спектра . 1Н ЯМР (δ, м . д ., J, Гц): 0,85 с (6H, 2(CH3)), 1,23c (42H, 21(CH2)), 1,47c (4H, 2(β-CH2)), 1,99c (4H, CH2CH=CHCH2), 2,20c (4H, 2(α-CH2)), 2,51c (2H, CH2-sn1), 3,81c (2H, H5′), 3,9c (2H, CH2-sn3), 4,06c (2H, H4′), 4,22д (1H, 1H, H3′, J = 4,2 Гц), 4,3 (1Н, H2′), 4,61д (1H, OH3′, J = 5,1 Гц), 4,7с (1H, OH2′), 5,08c (1H, CH-sn2), 5,29м (4H, (-CH=CH-) и -CH2-NH), 5,95д (1H, H1′, J = 5,8 Гц), 6,22д (1H, -CH=, J = 3,2 Гц), 6,32м (1H, -CH=), 7,49м (1H, =CH-O), 8,16c (1H, NH), 8,23c (1H, H-8), 8,41c (1H, H-2) .Заключение . Таким образом, в настоящей работе экспериментально обоснована возмож-ность использования препарата фосфолипазы D S. netropsis для препаративного синтеза ранее неизвестного коньюгата фосфолипида с фармакологически перспективным нуклеозидом – кине-тинрибозидом . Имеются основания полагать, что такая депонированная форма кинетинрибози-да будет способствовать его стабильности в русле крови и повышению адресности доставки в клетки-мишени .Литература1 . Alexander R. L., Kucera G. L. // Curr . �harm . Des . 2005 . Vol . 11, N 9 . � . 1079–1089 . 2 . Galmarini C. M., Popowycz F., Joseph B. // Curr . Med . Chem . 2008 . Vol . 15, N 11 . � . 1072–1082 .3 . Малекин С. И., Кругляк Ю. Л., Хромова Н. Ю. и др . // Биоорган . химия . 1997 . Т . 23, № 8 . С . 648–654 .4. Шастина Н. С., Мальцева Т. Ю., Дьякова Л. Н. и др . // Биоорган . химия . 2013 . Т . 39, № 2 . С . 184–193 .5. Birichevskaya L. L., Eroshevskaya L. A., Kisel M. A., Zinchenko A. I.  // Chem . Nat . Compd . 2006 . Vol . 42, N 1 . � . 32–35 . 6. Birichevskaya L. L., Kvach S. V., Sivets G. G. et al . // Biotechnol . Lett . 2007 . Vol . 29, N 4 . � . 585–591 .7. Shuto S., Itoh H., Sakai A. et al . // Bioorg . Med . Chem . 1995 . Vol . 3, N 3 . � . 235–243 .8. Damnjanovic J., Iwasaki Y. // J . Biosci . Bioeng . 2013 . Vol . 116, N 3 . � . 271–280 . 9. Griffaut B., Bos R., Maurizis J. C. et al . // Int . J . Biol . Macromol . 2004 . Vol . 34 . � . 271–275 .10. Cheong J., Goh D., Yong J. W. H. et al . // Mol . Biosyst . 2009 . Vol . 5 . � . 91–98 .11. Cabello C. M., Bair W. B., Ley S. et al . // Biochem . �harmacol . 2009 . Vol . 77 . � . 1125–1138 .Тонкослойная хроматограмма кинетин-рибозида (1) и реакционной смеси до (2) и после синтеза ФФА в течение 0,5 (3), 8 (4) и 17 (5) ч . Пятна кинетинрибозида и ФФА визуализированы при освещении УФ-светом12. McDermott S. P., Eppert K., Notta F. et al . // Blood . 2012 . Vol . 119, N 5 . � . 1200−1207 .13. Rajabi M., Gorincioi E., Santaniello E. // Nucleosides, Nucleotides, Nucleic �cids . 2012 . Vol . 31, N 6 . � . 474–481 . 14 . Береснев А. И., Ерошевская Л. А., Квач С. В., Зинченко А. И. // Весцi НАН Беларусi . Сер . бiял . навук . 2013 . № 3 . С . 73–77 . 15. Vaskovsky V. E. Kostetsky E. Y., Vasendin I. M. // J . Chromatogr . 1975 . Vol . 114, N 1 . � . 129–141 .A. I. VASILKEVICH, M. A. KISEL, L. A. EROSHEVSKAYA, A. N. RYMKO, A. I. ZINCHENKOvasilkevich@iboch .bas-net .by; kisel@iboch .bas-net .by; ljarosha@yandex .ru; ingecate@mail .ru; zinch@iboch .bas-net .bySYNTHESIS OF KINETIN RIBOSIDE PHOSPHATIDYL DERIVATIVE  USING STREPTOMYCES NETROPSIS PHOSPHOLIPASE DSummaryHerein, the environmentally friendly synthesis of the earlier unknown phospholipid analog of kinetin riboside was car-ried out using phospholipase D of Streptomyces netropsis. Kinetin riboside and soybean lecithin served as substrates . � maximum degree of nucleoside conversion to 5′-phosphatidyl derivative of kinetin riboside at 37°С to 6 h exceeds 95% . The structure of target product was confirmed by UV and 1Н NMR spectroscopy . 

СИНТЕЗ ФОСФАТИДИЛЬНОГО ПРОИЗВОДНОГО КИНЕТИНРИБОЗИДА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФОСФОЛИПАЗЫ D STREPTOMYCES NETROPSIS

https://doklady.belnauka.by/jour/article/download/207/209

СИНТЕЗ ФОСФАТИДИЛЬНОГО ПРОИЗВОДНОГО КИНЕТИНРИБОЗИДА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФОСФОЛИПАЗЫ D STREPTOMYCES NETROPSIS

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Reports of the National Academy of Sciences of Belarus