学位の種別: 課程博士審査委員会委員 : (主査)東京大学教授 豊島 陽子, 東京大学准教授 新井 宗仁, 東京大学准教授 佐藤 健, 東京大学准教授 道上 達男, 東京大学准教授 矢島 潤一郎University of Tokyo(東京大学

Ichikawa Muneyoshi

市川 宗厳

UTokyo Repository

論文の内容の要旨 
 
 
 
論文題目 
ダイニン複合体のサブユニット分子構築の研究 
Studies on Subunit Architecture of Dynein Complex 
 
氏名    市川 宗厳 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 真核生物では、高度に組織化された細胞骨格系と、細胞骨格上で ATP 加水分解に伴う構
造変化を用いて力発生するモータータンパク質が存在し、効率的な輸送や、細胞や組織の
秩序形成に関与している。本研究では、微小管骨格上で力発生するダイニンに着目した。
ダイニンは、細胞内での機能によって細胞質ダイニンと軸糸ダイニンに分類される。他の
モータータンパク質のキネシン・ミオシンについてはその運動機構についての詳細が明ら
かとなってきているのに対し、ダイニンの運動機構や制御機構は未だ十分には理解されて
いない。これは、ダイニン重鎖 HCが~500 kDaと巨大であり、その組換え体の発現系はこ
れまで細胞性粘菌や酵母の細胞質ダイニンに限られていたためであった。また、細胞質ダ
イニン・軸糸ダイニンともに、HC以外のサブユニットととともに巨大なタンパク質複合体
を形成しているが、このサブユニット構造が明らかとなっていないこともダイニンの制御
機構を理解することの妨げとなっていた。本研究では、組換え体としてダイニン複合体を
精製することのできる系を構築し、その性質、特にそのサブユニット構造を明らかとする
ことを目的とした。第 1章では軸糸ダイニン複合体内での軽鎖 LC1の局在と機能について、
第 2章では、細胞質ダイニン尾部のサブユニット構造について調べた。 
第 1章  外腕ダイニンにおける軽鎖 LC1の局在と調節機構 
 軸糸ダイニンのうちの外腕ダイニンは繊毛/鞭毛打を引き起こす主要なモータータンパク
質である。外腕ダイニン複合体は 3種類の重鎖(α, β, γHC), 2種類の中間鎖(IC), 多くの
軽鎖(LC)から構成されたタンパク質複合体であり、α, β, γHC それぞれの頭部ドメイン
が、尾部ドメインで束ねられた三頭構造をとっている。IC とほとんどの LC は尾部ドメイ
ンに結合するが、LC1 のみがγ重鎖の頭部ドメインに結合する。LC1 は外腕ダイニン複合
体の活性を制御する重要なサブユニットであるが、その制御機構は不明であった。これは、
LC1 が頭部ドメイン内のどこに結合するのかが明らかとなっていなかったためであった。
そこで、外腕ダイニン複合体内での LC1 の結合の実体を明らかとし、その機能についての
知見を得ることを目的とした。 
 まず、外腕ダイニン複合体内の LC1を直接標識して電子顕微鏡観察を行うため、テトラ
ヒメナにおいてLC1のC末に hsGFPタグ(ループ部分に金粒子標識用Hisタグが挿入され
たGFPタグ)を相同組み換えで付加した。LC1-hsGFPを含む外腕ダイニン複合体を精製し、
His タグを Ni-NTA ナノゴールドで標識し、電子顕微鏡観察したところ、ストーク上に金
粒子が結合し、LC1 がストーク上に存在していることが分かった(図 1a)。また、三頭のう
ち一頭のストーク先端の微小管結合ドメイン(MTBD)に LC1 に対応すると考えられる構造
体(ストーク上構造)が見出された。さらに、クラミドモナスで N 末または C 末に His タグ
を付加した LC1を発現し、外腕ダイニン複合体を精製してNi-NTAナノ金粒子標識を行っ
たところ、N 末側を標識した場合は、ストーク上構造の先端側が、C 末側を標識した場合
は、ストーク上構造の基部側がそれぞれ金粒子標識された。  
 ストークと LC1 の結合を生化学実験でも検証したところ、LC1 はα, β, γストークの
うちγストークのみにモル比 1:1で結合することが分かった。また、γストーク配列とβス
トーク配列のキメラコンストラクトを用いて LC1結合領域をマッピングしたところ、γス
トーク先端の MTBD 領域のみで LC1 結合には十分であることが分かった。さらに、γス
トークの微小管結合に対する LC1の影響を微小管共沈実験によって調べたところ、γスト
ーク単独のときに比べて LC1-γストーク複合体では、微小管に対するアフィニティーが下
がることが分かった。 
 上記の結果をまとめた LC1 の結合のモデルが図 1b である。本研究によって、一分子の
LC1 が N 末を先端側に、C 末を基部側に向けて、γ重鎖 MTBD 領域に結合することが分
かった。先行研究のモデルでは、LC1 は AAA+リングに結合すると考えられていたため、
AAA+リングから距離的に近い軸糸ダブレット微小管 A 小管に結合していると考えられて
いたが、本研究の結果を踏まえると、LC1はγMTBDとともに軸糸ダブレット微小管 B小
管に結合していると考えられる。また、LC1 がγストークの微小管へのアフィニティーを
図 2   
ダイニン 1複合体のサブユニット構造のモデル 
下げるという結果から、LC1がγMTBDの微小管へのアフィニティーを変化させることで
外腕ダイニンの活性を制御している可能性が示唆された。 
 
 
 
 
 
 
 
第 2章  細胞質ダイニン複合体の構造解析 
 細胞質ダイニンは、軸糸構造に組み込まれている軸糸ダイニンとは異なり、輸送するカー
ゴと結合し、微小管上を歩行するタイプのダイニンである。細胞質内で働くダイニン 1 と
繊毛・鞭毛内での輸送に関わるダイニン 2 が存在している。これらの構造と機能を調べる
ために、まず、HEK293細胞を用いて、これまで得られていなかったヒトダイニン 1HC全
長・ヒトダイニン 2HC 全長の発現系を構築することで、その性質を調べた。精製された組
換え体ダイニン 1HC全長, ダイニン 2HC全長はどちらも in vitroでの運動活性を有してい
た。電子顕微鏡観察で組換え体ダイニン 1 複合体は、内在性のブタ脳ダイニン 1 複合体と
同等の分子形態を示した。また、ダイニン 2 もダイニン 1 同様に二頭構造をとることが分
かった。これは、ヒトダイニン 1HC発現系を初めて構築した結果であるだけでなく、これ
までどの生物種でも明らかとなっていなかったダイニン2の in vitroでの性質を初めて示し
た結果である。 
 次に、積荷分子や、ダイナクチン, Ndel などの制御タンパク質との結合の足場となるダ
イニン 1 複合体の尾部ドメインの構築について調べた。ダイニン 1 複合体を電子顕微鏡観
察し、尾部ドメインについて単粒子解析を行った
ところ、ダイニン 1 複合体の尾部ドメインは 3
つのサブドメインから構成されていることが明
らかとなった。さらに、尾部ドメインに存在する
サブユニットの HC, IC, 中間軽鎖(LIC), LC 
(TcTex1, LC8, RB)のN末または C末に His-tag
を導入し、Ni-NTAナノゴールドによる標識を行
うことで、尾部ドメイン内でのサブユニットの位
置同定を行った。その結果、ダイニン 1複合体の
図 1 (a) 金粒子標識による LC1の位置同定 
   (b) LC1の結合様式のモデル 
(a) (b) 
尾部は、図 2 に示すようなサブユニット構造をとっていることが明らかとなった。これま
でのダイニン 1複合体の尾部サブユニット構造の推定モデルでは、ICはN末を尾部末端側、
C 末を頭部側に向けて結合していると考えられてきたが、本研究で得られた結果から、IC
の向きは先行研究の推定モデルとは逆向きであることが分かった。このモデルのようにサ
ブユニットが尾部ドメイン内に存在すると、IC の N 末や LC8 に結合するダイナクチンや
Ndelなどの制御タンパク質は、尾部ドメインの中の頭部ドメインに近い領域に結合すると
考えられる。これらの制御タンパク質が尾部ドメイン内の頭部に近い領域に結合すること
でその活性を制御している可能性が示唆された。 
 
総括 
 本研究では、主に、電子顕微鏡観察を用いて、外腕ダイニン複合体および細胞質ダイニ
ンのサブユニットの分子構築を調べた。この過程で、軸糸ダイニンおよび細胞質ダイニン
の組換え体の発現系をそれぞれ構築した。これらの発現系は、これまで酵母や細胞性粘菌
に限られていたダイニン重鎖の発現系の枠組みを広げ、組換え体を用いたダイニンの研究
の可能性を拓いたものである。今後、これらの発現系を用いて、重鎖に変異を入れた組換
え体ダイニン複合体を精製し、in vitroでの運動活性を調べることでその運動機構を調べる
ことも可能である。 
 本研究において、Ni-NTAナノ金粒子標識・単粒子解析と組み合わせた解析を行うことで、
外腕ダイニン複合体では、LC1 がγ重鎖の MTBD 領域に結合することを明らかにした。
LC1 についてはこれまで外腕ダイニン複合体の運動を制御することが知られていたが、そ
の機構については明らかとなっていなかった。本研究で得られた構造的基盤から、LC1 が
γMTBD の微小管へのアフィニティーを変化させる可能性が示唆され、生化学的手法によ
ってこのモデルが正しかったことも確認できた。また、細胞質ダイニン 1 尾部のサブドメ
イン構造と、サブユニットの対応を明らかとすることができた。その結果、制御タンパク
質が結合する領域が尾部の中の頭部モータードメインに近い領域に結合することが明らか
となった。以上のように、Ni-NTAナノ金粒子による標識は、ダイニンのような巨大な複合
体中でのサブユニットの位置同定に有用であった。また、本研究において、ダイニン複合
体中のサブユニットの分子構築を示し、ダイニン制御機構を明らかにする上で重要な構造
的基盤を提示することができたことは意義深い。今後、Ni-NTAナノ金粒子標識や単粒子解
析などの手法を応用することで、さらに、ダイニン 1-ダイナクチン複合体のような、制御
タンパク質とダイニンとの複合体の分子構築を明らかとし、ダイニンの運動制御機構の詳
細について明らかとすることも可能であろう。 


Studies on Subunit Architecture of Dynein Complex

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