取得学位 : 博士（医学）, 学位授与番号 : 医博甲第979号, 学位授与年月日：平成3年3月25日,学位授与年：199

Uchijima, Masato

内嶋 雅人

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学位授与番号学位授与年月日氏名学位論文題目医博甲第979号平成３年３月25日内嶋雅人へパドナウイルスのエンハンサー領域の保存された配列に結合する核タンパク質の精製とその性質論文審査委員主査副査教授教授教授助教授原漬小村夫治一史文元健清田木林上内容の要旨および審査の結果の要旨ヒトＢ型肝炎ウイルスを含むヘパドナウイルスは共通したゲノム構造をもち，ウイルス遺伝子の発現の調節に関与するエンハンサーは，Ｓ遺伝子とＸ遺伝子の間の約０．２ｋｂの領域に存在する。この領域にはいくつかのタンパク質結合部位が存在することが報告されているが，各部位のエンハンサー活性における役割及び結合するタンパク質については明らかにされていない。著者はヘパドナウイルスのエンハンサー領域中に保存されている３３ｂｐの配列の中央部分に存在する２３ｂｐの配列（ＨＥ－Ｃ）がエンハンサー活性に本質的であることを明らかにすると共に，ＨＥ－Ｃ配列に特異的に結合するタンパク質を精製し，その性質を調べた。肝癌由来のＨｅｐＧ２細胞から核抽出液を調製し，４種類の異なるカラムクロマトグラフィーを行うことにより，ＨＥ－Ｃ配列に結合するタンパク質を部分精製した。この画分を新たに調製したＨＥ－ＣＤＮＡアフィニティーカラムで分離することにより，分子量７０ｋｄ及び８５ｋ。の２つの成分からなるタンパク質複合体を高純度に精製することに成功した。精製タンパク質のＤＮＡ結合特異性を調べるために，ＨＥ－Ｃ配列及びＨＥ－Ｃ中に存在する２つの特徴的なモチーフ，ＴＧＡＣＧとＣＣＣＣＣにそれぞれ２塩基の置換を加えた配列（ｍｌｍ２）をプローブとしてゲルシフトアッセイを行った結果，精製タンパク質はＨＥ－Ｃ配列とのみ結合することが明らかになり，このＤＮＡ－タンパク質複合体の形成は塩基配列特異的であることが確認された。また，ＨＥ－Ｃ配列のエンハンサー活性もＤＮＡ－タンパク質複合体形成と同様の塩基配列特異性を示すことから，この精製タンパク質がエンハンサー活性に直接関与する因子であることが示唆された。更に，精製タンパク質とＨＥ－Ｃ配列の結合様式を調べるためにＵＶクロスリンキング実験を行った結果，２つのタンパク質成分のうち７０ｋ。のものがＨＥ－Ｃと直接結合することが示され，８５ｋｄのタンパク成分はタンパク質間の相互作用によって７０ｋ。のタンパク成分と結合して２量体を形成することが示唆された。以上，本研究はヘパドナウイルス遺伝子の転写調節に必須と考えられるエンハンサー結合タンパク質を精製し，エンハンサー配列との結合特異性を明らかにしたものであり，ウイルス遺伝子発現の制御機構解明に重要な知見を与えるものと評価された。－２３－

ヘパドナウイルスのエンハンサー領域の保存された配列に結合する核タンパク質の精製とその性質

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