Studio degli effetti miscela sullo sviluppo embrionale in vitro di due composti con diverso meccanismo d’azione (fluconazolo ed etanolo) utilizzando due diversi modelli sperimentali: coltura di embrioni di ratto e esposizione di embrioni di Ascidia

Abstract

Scopo di questo lavoro \ue8 stato quello di valutare in vitro gli effetti miscela sul potenziale teratogeno della co-esposizione a Fluconazolo (FLUCO, fungicida azolico ampiamente utilizzato in ambito clinico) ed a concentrazioni sub-teratogene di Etanolo (Eth). Nella prima parte di questo studio, embrioni post-impianto di ratto sono stati esposti in vitro a concentrazioni crescenti di FLUCO (62.5-125-250-500\ub5M), alla concentrazione non effetto di Eth (1\ub5L/mL) o sono stati co-esposti a FLUCO 62.5-125-250-500\ub5M ed Eth (1\ub5L/mL). Al termine del periodo di coltura (48 ore) gli embrioni sono stati esaminati morfologicamente e processati per valutare l\u2019espressione dei geni specificamente coinvolti nel metabolismo dell\u2019Acido Retinoico (adh7, cyp26a1, cyp26b1, cyp26c1) o la distribuzione delle loro proteine nell\u2019embrione. Eth da solo non ha indotto effetti avversi sullo sviluppo embrionale. I gruppi esposti a FLUCO 125-250-500\ub5M mostravano specifiche anomalie a livello dell\u2019apparato branchiale, comparabili a quelle precedentemente documentate e correlate ad un probabile aumento di RA. Gli effetti erano dose-dipendenti sia per la frequenza degli embrioni malformati che per la gravit\ue0 delle malformazioni osservate. FLUCO 62.5 \ue8 stata individuata come la NOAEL (No Observed Adverse Effect Level). Gruppi co-esposti a FLUCO ed Eth mostravano un aumento significativo dell\u2019effetto teratogeno rispetto ai gruppi esposti al solo FLUCO. In seguito alla co-esposizione con Eth, FLUCO 62.5 \ub5M mostrava pi\uf9 del 35% degli embrioni anomali. Tale concentrazione non era pi\uf9 identificabile come NOAEL. L\u2019analisi dell\u2019espressione genica ha rivelato che la sola esposizione a Eth o a FLUCO 62.5 \ub5M alterava l\u2019espressione di geni coinvolti nel catabolismo di RA (cyp26a1, cyp26c1) e che tale alterazione peggiorava in seguito alla co-esposizione. La immunocolorazione per CYP26a1 e CYP26c1 non ha evidenziato differenze nelle aree embrionali coinvolte nella loro espressione, che risultavano sovrapponibili nell\u2019area cefalica ai territori di espressione del marker delle cellule delle creste neurali (CRABP1). I dati ottenuti mostrano che la co-esposizione con Eth alla concentrazione sub-teratogena pu\uf2 aumentare il potenziale teratogeno del FLUCO. Questi risultati sono di particolare rilevanza considerando che FLUCO ed Eth non condividono lo stesso meccanismo d\u2019azione: FLUCO interferisce con il catabolismo di RA, mentre Eth potrebbe interferire con la sintesi endogena di RA. L\u2019analisi dell\u2019espressione dei geni correlati al metabolismo di RA suggerisce che l\u2019effetto miscela indotto da FLUCO ed Eth potrebbe essere spiegato da un accumulo di RA dovuto all\u2019azione delle due sostanze. Nella seconda parte di questo studio, embrioni dell\u2019ascidia Ciona intestinalis (Chordata, Tunicata) sono stati esposti in vitro dallo stadio di neurula allo stadio di larva natante a concentrazioni crescenti di FLUCO (31.5-62.5-125-250-500\ub5M), alla concentrazione non effetto di Eth (1\ub5L/mL) o sono state co-esposte a FLUCO 62.5-125-250-500\ub5M ed Eth (1\ub5L/mL). Al termine del periodo di coltura (15 ore) le larve sono state esaminate morfologicamente. Eth da solo non ha indotto effetti avversi sullo sviluppo embrionale, mentre i gruppi esposti a FLUCO mostravano specifiche anomalie a livello delle strutture anteriori, comparabili a quelle gi\ue0 documentate e correlate all\u2019esposizione a RA. \uc8 stato osservato un significativo aumento di larve con malformazioni gravi nei gruppi co-esposti alle miscele di FLUCO ed Eth. I dati preliminari ottenuti sembrano indicare l\u2019ascidia come un adeguato modello alternativo per lo screening teratogeno delle miscele ottenute da fungicidi azolici: viene confermata l\u2019ipotesi di un ruolo chiave dell\u2019Eth nell\u2019aumentare il potenziale teratogeno del FLUCO, puntando l\u2019attenzione su un possibile impatto ambientale dei fungicidi azolici