Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Plasmodium is the causative agent of malaria, a disease that caused 781 thousands deaths during the year of 2009. The apicomplexan responsible for this disease have shown to be very well adapted to both mosquito and Vertebrate hosts, regulating its gene expression often in a posttranscriptional manner. Recently the protein HoMu and the translation initiation factor eIF4E (4E) were found forming complexes with translationally arrested mRNAs (e.g. transcripts encoding the surface proteins p25 and p28). Storage of these mRNAs in the female gametocyte will permit the parasite to have them readily available to be translated once it enters into the mosquito. Using bioinformatics tools we showed that HoMu and 4E are conserved proteins. Their homologs are distributed in a wide range of species and participate in both translation initiation and arrest of transcripts containing specific sequences in their 3’ untranslated regions (UTRs). The main purpose of this study was to understand when those proteins are expressed during the Plasmodium berghei life cycle and where they are localized. We also show that parasite lines expressing GFP fused to HoMu and 4E are able to establish infection with normal parasitological patterns compared to the wild type. By life cell imaging of these mutant lines we find that HoMu and 4E are strongly expressed in gametocytes, oocysts, and sporozoites suggesting that they are important during the transmission phases of the P.berghei life cycle.A malária é uma doença causada pelo parasita unicelular Plasmodium e transmitida pela picada do mosquito Anopheles. Segundo os dados da organização mundial de saúde (OMS) esta doença vitimou em 2009 cerca de 780 mil pessoas, sendo a maioria crianças que habitavam na África subsariana. São quatro as espécies deste parasita que infectam o Homem: Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, e Plasmodium falciparum, sendo a última a causadora da forma mais severa da doença conhecida como malária cerebral. Actualmente a investigação em parasitologia molecular procura desvendar quais os processos celulares que estão por de trás da interacção deste parasita com o hospedeiro. Como tal e visto ser ainda difícil reproduzir todo o ciclo de vida de Plasmodium em laboratório é necessário utilizar um hospedeiro passível de ser mantido em cativeiro e que sirva de modelo para o estudo da malária. A malária infecta também roedores e é sabido que as espécies do parasita que os infectam partilham elevado número de genes com as espécies da malária humana. Como tal é muitas vezes utilizado em investigação o parasita de roedores Plasmodium berghei. O parasita da malária caracteriza-se pela sua rápida adaptação ao hospedeiro. Durante a fase sanguínea o parasita invade os eritrócitos e diferencia-se em células precursoras dos gâmetas, os gametócitos. Estas células caracterizam-se por possuir complexos contendo mRNA e proteínas específicos no seu citoplasma onde a tradução é inibida. Pensa-se que estes complexos estão relacionados com o controlo da expressão génica no parasita da malária. De facto poucos factores de transcrição são ainda conhecidos em Plasmodium, por outro lado, as proteínas de ligação ao RNA são particularmente abundantes neste parasita. Estas observações reforçam a hipótese de que, em Plasmodium a regulação génica ser feita preferencialmente ao nível pós-transcricional. Em gametócitos femininos de Plasmodium foram identificadas ribonucleoproteínas (mRNP) como DOZI e CITH formando complexos onde o mRNA é armazenado. Ao gerar-se linhas celulares mutantes do parasita sem estas proteínas codificadas no seu genoma verificou-se que este não se diferenciava em oocinetos após a formação do zigoto. Fazendo parte dos mesmos complexos foram encontradas outras proteínas, entre elas uma proteína homóloga de Musashi (HoMu) e um factor de iniciação da tradução eIF4E (4E). Estas proteínas são o alvo deste estudo e possuem homologia com proteínas de diferentes espécies de seres vivos. HoMu por exemplo possui homologia com a proteína Musashi do sapo Xenopus. Neste animal a proteína Musashi liga-se ao mRNA mos de oócitos activando a sua tradução. Noutras espécies, no entanto, Musashi caracteriza-se por inibir a tradução de certos mRNAs, armazenando-os no citoplasma em complexos de mRNP. Já 4E por outro lado é um factor de iniciação da tradução em células eucariotas que juntamente com outros factores permite activar o mRNA para ser traduzido. No entanto esta proteína participa também em processos de inibição da tradução, integrando complexos de mRNP onde o mRNA é armazenado. Em Drosophila por exemplo a proteína Cup liga-se a 4E impedindo a formação do complexo de iniciação da tradução. Este projecto teve como objectivo principal identificar o padrão de expressão das proteínas HoMu e 4E durante o ciclo de vida do parasita P. berghei. Para isso foram utilizadas duas linhas celulares contendo os genes homu e eif4e de fusão com o gene gfp (green fluorescent protein) de forma a possibilitar a identificação da expressão de HoMu e 4E por análise da fluorescência. As duas proteínas revelaram ser expressas na fase sanguínea bem como no mosquito, sugerindo a importância de ambas no ciclo de vida de Plasmodium. Foi demonstrado neste projecto que as linhas celulares GFP possuem um desenvolvimento normal quando comparado com a linha selvagem. A cinética de crescimento do parasita mutante durante a fase sanguínea foi idêntica à do selvagem e os números de esporozoítos nas glândulas salivares do mosquito foram normais. Isto comprova que as linhas celulares GFP utilizadas neste projecto são viáveis para o estudo das proteínas HoMu e 4E. Finalmente, a análise bioinformática das regiões 3’ UTR (untranslated regions) dos quase 5000 genes codificantes de proteínas identificados até então em P. berghei revelou que muitos deles possuem sequências consensus nas quais as proteínas Musashi de outros seres vivos se ligam. Isto leva-nos a sugerir que o homologo de Musashi em Plasmodium possa também ligar-se às regiões 3’ UTR de diversos mRNAs inibindo ou não a tradução dos mesmos
