Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Insect cells, in particular the Spodoptera frugiperda Sf9 cell line, are a popular system for the production of biologically active recombinant proteins. However, the current technology uses baculovirus infection which has two main disadvantages: firstly, the recombinant gene is only expressed transiently during the infection cycle, after which cells die; secondly, due to the lytic nature of this system, the cellular protein processing machinery is severely compromised at the end of the infection cycle, affecting the correct formation of recombinant proteins whose expression is usually controlled by very-late baculovirus promoters. Stably transformed insect cell lines represent an alternative system for continuous protein production. However, their establishment is laborious, requiring the identification of cell clones that display the right expression properties due to random integration of the gene-of-interest. Furthermore, independently of the expression system, multimeric biopharmaceuticals continue to have very low yields, mainly because the stoichiometry between components is not properly reached in the producer cells. To overcome these issues, this report shows work towards the development of a novel Sf9 cell factory combining (i) recombinase mediated cassette exchange (RMCE) for targeted gene integration and (ii) a tetracycline (Tet) inducible system for the modulation of gene expression levels. We started by evaluating the strength of different promoters to drive GFP expression in Sf9 cells as well as different transfection protocols. The baculovirus promoter OpIE2 allowed the strongest expression when compared to others, and the efficiency of transfection was significantly higher using the lipotransfection method. From the different transfection protocols, 4 cell populations with distinct fluorescence distributions were obtained after 3 weeks under hygromycin selection. These populations were independently subject to limiting dilution and isolated cell clones were analyzed by southern blot to screen for single-copy integration of the tagging GFP construct. While the majority of clones were single copy, cassette exchange was performed in a few clones by co-transfection with flippase and the target plasmid containing dsRed. Cells were selected in the presence of neomycin and cassette exchange was confirmed by PCR of genomic DNA, revealing the absence of tagging cassette and the presence of the target cassette in the some locus. In parallel, the functionality of a tetracycline inducible system in Sf9 cells was evaluated by substituting mammalian promoters with insect cell specific promoters. However, transactivation was suboptiomal, requiring additional changes to the original system. In summary, this work reports for the first time the implementation of a RMCE system in Sf9 cells and a preliminary assessment of Tet transactivation in these cells. This new cell line will be a major breakthrough since it will combine the advantages inherent to Sf9 cell growth, continuous protein production, the ability of re-using a well characterized locus for targeted DNA integration and inducible gene expression.A cultura de células de insecto conjugada com a infecção por baculovirus representa um dos sistemas biológicos de eleição para a produção de proteínas recombinantes biologicamente activas. Há vários biofármacos em ensaios clínicos e alguns já no mercado, como é o caso da vacina contra o vírus do papiloma humano (Cervarix, GSK), que utilizam este tipo tipo de sistema de expressão. No entanto, o uso de baculovirus representa um sistema de expressão transiente / lítico inerente ao processo de infecção. Em contraste, quando estavelmente transformadas, as células de insecto podem ser usadas como um sistema de expressão contínuo e não-lítico. Contudo, o desenvolvimento de linhas celulares estáveis é significativamente demorado e laborioso, sendo necessário identificar e isolar clones que exibam elevadas taxas de expressão. A grande variabilidade existente nos níveis de expressão entre clones deve-se ao chamado efeito de posição, ou seja a aleatoriedade de integração no genoma da célula. Além disso, e independentemente do sistema de expressão, quando se pretende expressar biofármacos multiméricos, como as particulas semelhantes a vírus, estes continuam a ter rendimentos muito baixos. A estequiometria entre os componentes é um factor chave e, quando não é alcançada adequadamente nas células produtoras, resulta na formação de uma grande percentagem de partículas incorrectamente formadas. De forma a superar estas limitações, neste trabalho é iniciado o desenvolvimento de uma linha celular derivada de Spodoptera frugiperda, usando uma combinação de duas tecnologias: (i) sistema de troca de cassete mediada por recombinase (RMCE) e (ii) circuito transcricional indutível. Os sistemas RMCE utilizam um eficiente e avançado processo de troca génica localizada por intermédio de uma reacção de recombinação. Anteriormente implementada em células de mamífero, este tipo de tecnologia foi agora aplicada num cenário de expressão estável em células de insecto com o objectivo de permitir o uso repetido de locais genómicos pré-caracterizados com elevada taxa de expressão. Já os circuitos indutíveis sintéticos, como o sistema de indução por tetraciclina, permitem ajustar a expressão de diferentes genes de interesse por intermédio de um indutor, facilitando a produção de produtos multiméricos correctamente formados. O trabalho desenvolvido nesta dissertação de mestrado começou por centrar-se na análise de diferentes promotores no controlo da expressão de genes repórter na linha celular Sf9. Foram estudados promotores com diferentes origens mas com uma base de funcionamento comum em células de insecto, como os promotores de baculovirus OpIE2 e OpIE1, o promotor da metalotioneína e o das proteínas de choque térmico (hsp70) de Drosophila. Em resultado, verificou-se que o promotor OpIE2 superou consideravelmente os restantes na expressão de eGFP. Por outro lado, o promotor da metalotioneína induzido por cobre revelou ser um sistema desadequado para expressão de proteínas de interesse em células Sf9, uma vez que apenas para doses citotóxicas se verificou uma expressão de eGFP mensurável. Para o funcionamento do sistema RMCE são necessários dois vectores distintos e complementares (Tagging / Target). Em ambos os vectores foi utilizado o promotor OpIE2 para a expressão das proteínas repórter (diferentes nos dois vectores: Tagging – dsRed; Target - eGFP), e o promotor OpIE1foi usado para a expressão do agente de selecção, necessário para garantir a expressão estável dos dois vectores no genoma da célula (Tagging – higromicina; Target -neomicina). Enquanto a integração do plasmídeo Tagging no genoma se dá através de um processo aleatório, a integração do Target é o resultado da troca bem-sucedida por recombinação enzimática. A selecção pelo agente neomicina assegura o sucesso da troca génica uma vez que o gene de resistência é activado pela inserção de um códão de iniciação (ATG) presente apenas no Target. Antes do processo de troca, é importante que apenas uma cópia da cassete Tagging seja integrada no genoma da célula para que o sistema RMCE seja funcional. Utilizaram-se dois métodos em paralelo para transfectar as células Sf9 com o plasmídeo Tagging: lipotransfecção usando cellfectin e eletroporação, donde resultaram quatro populações celulares com distribuições de fluorescência distintas. Para cada população de células foi posteriormente realizada uma diluição progressiva para a obtenção de clones produtores, os quais foram analisados por citometria de fluxo para comparar o nível de expressão de eGFP. Posteriomente, foi implementado um protocolo de Southern blot para analisar o número de cópias integradas da cassete Tagging em cada clone., Dos nove clones analisados, apenas um revelou ter mais do que uma cópia. Em alguns dos clones com apenas uma cópia procedeu-se à co-transfecção da construção Target com a enzima recombinase (flippase). Foi possível seleccionar células resistentes à neomicina sugerindo o sucesso da troca de cassetes, tendo sido mais tarde confirmado por meio de PCR do DNA genómico e de RT-PCR do RNA dos genes repórteres.No que toca o circuito indutível de transcrição, o trabalho conduzido teve como objectivo fazer uma avaliação preliminar da sua funcionalidade em células Sf9 antes da implementação directa na cassete de recombinação. No entanto, os resultados revelaram uma fraca indução por parte do agente tetraciclina, justificando a necessidade de uma optimização do sistema original. Em conclusão, com este trabalho reportamos pela primeira vez a implementação bem sucedida de um sistema de troca de cassete por intermédio de recombinação enzimática em células Sf9. Esta tecnologia representa um grande avanço na produção de novas linhas celulares de insecto, combinando as vantagens inerentes à cultura deste tipo de células com a possibilidade de atingir elevados níveis de expressão contínua de diferentes proteínas recombinantes através da fácil integração de genes de interesse no genoma celular
