Gloning, K.-P.

German

Open Access LMU

DG Klinische Chemie Mitteilungen 24 (1993) Heft 2 83 Steroide als immunchemische Sonden und Immunglobuline als steroidanalytische Reagenzien R. Goebel Frauenklinik am Evangelischen Krankenhaus Oberhausen Im Jahre 1970/1971 wurden im Laboratorium für Klinische Chemie und Biochemie der I. Frau-enklinik der Ludwig-Maximilians-Universität München Anti-Östrogen-C6-Konjugat-Antiseren entwickelt, die im Rahmen der Schwangeren-überwachung als entscheidendes Reagenz bei der radioimmunologischen Östrogenbestim-mung bis heute Bedeutung haben. Die bis da-hin verwendeten Antiseren zur Bestimmung von Plasma- oder Serumöstrogenen im Radioimmu-noassay zeigten eine deutliche Kreuzreaktivität mit anderen Steroiden. Aufgrund der praktisch zu vernachlässigenden Kreuzreaktivität der neuen Anti-Östrogen-Antisera mit anderen Ste-roiden bestand die Möglichkeit, ohne vorherige Chromatographie die einzelnen klassischen Östrogene zu bestimmen. Die Vorteile der Se-~~m-Östrogen-Bestimmung gegenüber der Urin-Ostrogen-Bestimmung bestehen darin, daß kei-ne Verzögerung bei der Bestimmung der Östro-gene im 24-Stunden-Urin durch die 24stündige Sammelzeit und die möglichen Sammelfehler eintritt. Von wenigen Ausnahmen abgesehen, dürfte es keine Rolle spielen, ob das Gesamt-östriol oder das unkonjugierte Östriol im Serum bestimmt wird. Der diagnostische Wert der Östriolbestimmung im klinischen EntscheidunJJsprozeß: Am häufig-sten werden erniedrigte Ostriolkonzentrationen bei Schwangerschaften mit intrauteriner fetaler Wachstumsretardierung gefunden; häufig auch bei Patientinnen, bei denen eine schwanger-schaftsinduzierte Hypertonie zu einer intrauteri-nen fetalen Wachstumsretardierung geführt hat. Allerdings ist der prädiktive Wert des un-konjugierten Östriols zur Erkennung einer feta-len Dystrophie nicht sehr hoch (positiver prädik-tiver Wert liegt bei 35%). Auch wenn die Östri-olbestimmung im mütterlichen Serum im Kon-zert der heutigen Überwachungsmethoden zur Bewertung einer Risikoschwangerschaft nicht mehr die hohe Rangordnung hat, wie es noch vor etwa 15 Jahren der Fall war, stellt sie den-noch im Vergleich mit anderen chemischen Überwachungsmethoden die zuverlässigste chemische Methode zur Überwachung von Ri-sikoschwangerschaften dar. Anschrift des Verfassers: Prof. Dr. R. Goebel, Evangelisches Krankenhaus, Frauenklinik, Virchowstraße 20, D-W 4200 Oberhausen Kinetik der Assoziation von Östrogenen mit ihren korrespondierenden Antiöstrogen-Antikörpern K.-P. Gloning I. Frauenklinik der Ludwig-Maximilians-Universität München In Fortsetzung des Forschungsvorhabens "Ste-roide als immunchemische Sonden" wurde die Kinetik der Assoziation von Östrogenen mit ih-ren korrespondierenden Antiöstrogen-Antikör-pern und die der Dissoziation der jeweiligen Komplexe untersucht, und es wurden die Reak-tionsenergien und -enthalpien ermittelt. Die Er-gebnisse können wie folgt zusammengefaßt werden: 1. Im Gleichgewicht wurde die Bindung von 3H-E2 an die Antikörper durch alle unmarkierten li-ganden, die getestet wurden, signifikant ge-hemmt. Die Non-Parallelität der Hemmungskur-ven ist wahrscheinlich bedingt durch die Hete-rogenität der Antikörper. Unter der Annahme, daß der Einfluß der Heterogenität der Bin-dungsenergie ein Minimum bei einer Hemmung von 50% erreicht, wurde die Dosis, die 50% Hemmung bewirkt, gewählt, um eine Rangord-nung der Haptene entsprechend ihrer 1050 anzugeben. Diese Abfolge war gleich bei allen untersuchten Antiseren (Tab. 1). 2. Die geringe Hemmung durch E2-~7 kann durch den Verlust· der Koplanarität des Mole-84 DG Klinische Chemie Mitteilungen 24 (1993) Heft 2 Tab. 1: Bindung von unmarkierten Östradiol-C6-De-rivaten durch Anti-Östradiol-C6-Konjugat-Antiserum Relative Hemmung der 3H-E2 Bindung Die Konzentrationen, die erforderlich sind, die Bin-dung von 3H-E2 durch das Antiserum um 7S%, SO% und 2S% von BO zu hemmen (ID2S' IDSß 1079, sind in bezug zu Ez=100% Hemmung angegeben. 1075 1050 1025 E2-117 3 0,6 0,1 E2-116 112 95 85 E2 100 100 100 E2-6a-ol 50 52 54 E2-6ß-ol 26 26 26 E2-6-on 169 166 162 E2-6-oxim-O-ME 73 121 200 E2-6-CMO 58 93 150 E2-6-.CMO-histamin 67 121 219 E2-6-CMO-ACA 77 128 219 E2-6-CMO-Lys 67 121 219 küls nach Einfügen einer C7-C8-Doppelbindung leicht erklärt werden. Die Koplanarität des Östrogen moleküls ist nicht gestört durch die Doppelbindung an C6-C7. Demgemäß zeigte E2-86 eine Hemmung entsprechend E2. 3. Die Hemmung von E2-6a-OH übersteigt die von E2-6j3-0H. Die äquatoriale 6a-OH-Gruppe paßt offenbar besser in die Bindungsstelle am Antikörper als die axiale 6j3-0H-Gruppe. 4. Bei E2-6-on war die Hemmung eindeutig hö-her als bei E2, und dieses Hapten zeigte die höchste Hemmung der Bindung, die. in dieser Untersuchung beobachtet wurde. E2-6-on wird für identisch mit dem steroidalen Kern der Im-mundeterminante gehalten, einschließlich der sp2-Hybridisierung an C6. Das Ausmaß der Hemmung ist abhängig von der Assoziations-konstante. Es ist daher bei Beachtung der ste-roidspezifischen Antikörperfraktion sehr un-k'2X 10,6 (litre x mol" x s") wahrscheinlich, daß der Wert eines steroidalen Haptens für K, selbst wenn in der Brückenregi-on mit einem großen Jodatom markiert wird, den K-Wert des reinen Steroids übersteigen würde, falls die molekulare Konformation der Immundeterminante entspricht. 5. Die Werte für K hängen von bei den Ge-sChwindigkeitskonstanten, der Assoziations-und der Dissoziationsgeschwindigkeitskon-stante k12 und k21 , ab. Weil sich die Geometrie von E2-6-on von E2-6-CMO-Lys deutlich unter-scheidet, mag der niedrigere Wert für K des letzteren mehr von der niedrigeren Assoziati-onsgeschwindigkeit bestimmt werden als von einer höheren Dissoziation, die Ausdruck der Affinität ist. 6. Offenbar kann die Assoziationsreaktion un-markierter Haptene mit Antikörpern durch die "Methode der sequentiellen Inkubation" zutref-fend verfolgt werden: E2-6-on lagert sich schneller an als die Haptene mit längeren Brückengliedern. Unter diesem Gesichtspunkt sind die absoluten Werte der Geschwindigkeits-konstanten weniger wichtig (Tab. 2). 7. Die Dissoziationsreaktion des unmarkierten Hapten-Antikörper-Komplexes, beobachtet durch "sequentielle Inkubation", ist in einem Be-reich bis 90% der anfänglichen Konzentration des Komplexes offenbar monophasisch. Die Er-gebnisse zeigen eindeutig, daß E2-6-oxim-O-ME durch den Antikörper am dichtesten gebun-den wird, im Vergleich zum E2-6-on-Komplex mit der doppelten Halbwertszeit. Die Zuver-lässigkeit der Reihenfolge der Affinität wird un-terstützt durch die Halbwertszeit der Komplexe von E2-6a-OH, E2-6j3-0H und E2, deren Rei-henfolge mit den Werten für die Hemmung die-ser Haptene übereinstimmt. Es kann angenom-Anti-E2-AS Anti-E2-As Anti-E2-As E2-6-on E2-6-oxim-O-ME E2-6-CMO E2-6-CMO-Lys 02 E2 F2 1,07 0,83 0,70 0,45 0,45 0,43 0,45 0,32 0,34 0,36 0,36 0,35 Tab. 2: Bindung von unmarkierten Östradiol-C6-Derivaten durch Anti-Östradiol-C6-Konju-gat-Antiserum Assoziationsgeschwindigkeitskonstante k 12 DG Klinische Chemie Mitteilungen 24 (1993) Heft 2 85 k21 X 104 t1/2 (s-l) (m in) Anti-E2-As Anti-E2-As Anti-E2-AS D2 E2 E2-6{3-0H 4,04 4,15 E2-6a-OH 3,21 3,34 E2 2,59 2,64 E2-6-on 1,36 1,18 E2-6-oxim-O-ME 0,58 0,61 E2-6-CMO 0,64 0,68 E2-6-CMO-histamin 0,64 0,64 E2-6-CMO-Lys 0,93 0,92 men werden, daß die Assoziationsgeschwin-digkeiten gleich sind, da Unterschiede in der Geometrie dieser Moleküle nicht von Bedeu-tung sind (Tab. 3). Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die "Methode der sequentiellen Inkubation" zur Bestimmung von Reaktionsgeschwindigkeiten eine zuverlässige Möglichkeit für immunche-mische Affinitätsstudien darstellt. Die praktische Nutzanwendung der Ergebnisse dieses mehr theoretischen Konzeptes ergab sich bei der Suche nach einem geeigneten 125J_ markierten Indikator-Hapten für die radio-immunologische Östrogen-Bestimmung. 125J als Indikator-Atom erleichtert als gamma-Strahler die Meßtechnik, es vermindert aber infolge seiner räumlichen Ausdehnung die Affinität des korrespondierenden Antikörpers, sofern es ein H-Atom im immundominanten Bereich des Li-Abb. 1: Östriol-Konzen-tration im Serum in der späten Schwangerschaft, bestimmt durch Radioim-munoassay 20 ~15 ! ~ ~ ~1O ~ ~ A . " .. /~:~':.: 1. . /0 F2 3,91 3,32 2,64 1,43 0,59 0,64 0,66 0,90 28 35 45 80 200 180 180 130 Tab. 3: Bindung von unmarkierten Östradiol-C6-Derivaten durch Anti-Östradiol-C6-Konjugat-Antiserum Dissoziationsgeschwindigkeitskon-stante k21 und Halbwertszeiten ganden substituiert. Zur Markierung kann das Brückenglied des Immunogens herangezogen werden ("homologe Markierung"). Dies ist rela-tiv einfach und wurde deswegen häufig prakti-ziert. Diese Technik ist jedoch, wie oben gezeigt, mit mindestens einem Nachteil behaftet. Der korre-spondierende Antikörper bindet Liganden mit Brückenglied mit höherer Affinität als Liganden ohne Brückenglied, zu denen im allgemeinen der Analyt gehört. Der Nachteil resultiert in verminderter analytischer Sensitivität der Be-stimmung. Selektive Jodierung von Östrogen-molekülen ohne Brückenglied ist in der Nach-barschaft ihrer phenolischen Hydroxylgruppe an C2 und C4 relativ einfach zu erreichen. Nach den oben erwähnten Ergebnissen ist an-zunehmen, daß ein J-Atom an C4 des Steroids vom Antikörper weniger gut "erkannt" wird als B 20 Korrelation der Ergeb-nisse mit 2_ 125J (A) oder 4_ 125J (B) und 3H-Östriol als Indikatorliganden '. o,~~--~-----__ ----__ __ o 5 10 15 'l"'-----__ ----__ --~ 5 10 15 ~-method estrkll [jJg/!] 3H-method estriol [IJQ/I] 86 DG Klinische Chemie Mitteilungen 24 (1993) Heft 2 ein J-Atom an C2, daß also für den Indikator C4-J-Östrogen eine etwa gleiche Affinität zu erwarten ist wie für den Analyt Östrogen, wor-aus optimale analytische Sensitivität resultiert. Die Ergebnisse der jeweiligen Bindungsexperi-mente (Auswertung über logit-Iog-Standardkur-ven) und die Vergleiche mit anderen Analyse-verfahren (Auswertung über standardisierte Hauptkomponente) brachten die empirische Bestätigung der theoretischen Ableitungen (Abb.1). Literatur Kuss, E., Dirr, W., Goebel, R., Gloning, K., Hötzinger, H., Link, M., Thoma, H. Steroids as immunochemical probes. Thermodynamic and kinetic data with special regard to the "bridge problem" in estrogen radioimmunoassay. In: Radioimmunoassay and Related Procedures in Medicine, International Atomic Energy Agency, 1978; 1: 69-89 2 Gloning, K., Dibbelt, L., Kuss, E. 2- and 4-iodinated estriol as indicator ligands for estriol radioimmunoassays with anti-estriol-C6 conju-gate antiserum. J. Immunol. Methods 1989; 122: 185-193 Anschrift des Verfassers: Dr. K.-P. Gloning, I. Frauenklinik der Ludwig-Maximilians-Universität, Maistraße 11, D-W 8000 München 2 Katecholöstrogene: Nur Objekte des Laboratoriums oder Effektoren des Organismus? FD. Berg I. Frauenklinik der Ludwig-Maximilians-Universität München Katecholöstrogene (2-Hydroxyöstrogene, 4-Hydroxyöstrogene) und ihre Methyläther sind Metabolite des Follikelhormons Östradiol-17ft Als ortho-Diphenole ähneln sie den Katechol-aminen. Sie können also, zumindest formal, als Bindeglied zwischen den Östrogenen des Ovars und den Neurotransmittern des zentralen Nervensystems angesehen werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung zuverlässiger Analyseverfahren für serielle Be-stimmungen dieser alkali- und oxidationsemp-findlichen Substanzen und die Erstellung von Referenzbereichen ihrer Konzentrationen in Serum und Urin von Frauen im Menstruations-zyklus, in der Schwangerschaft und in der Post-menopause als Beitrag zur näheren Charakte-risierung ihrer bisher unklaren physiologischen Bedeutung. Nach Synthese geeigneter Immunogene und 125J-markierter Indikatorliganden wurden Anti-körper induziert und radioimmunologische Ana-Iyseverfahren mit hoher Spezifität, Empfindlich-keit und Präzision entwickelt. Die Ergebnisse der Bestimmungen zeigten, daß die o-Hydroxylierung des aromatischen Ringes einen wichtigen Schritt im Stoffwechsel der Östrogene darstellt. Die Konzentrationsverläufe der Katecholöstrogene ähneln dem der "klassi-schen" Östrogene (Östradiol, Östron, Östriol) im Zyklus und im ersten und zweiten Trimenon der Schwangerschaft. Im dritten Trimenon der Schwangerschaft steigt die Konzentration der Katecholöstrogene nicht mehr an, wohl aber die des Östradiol und des Östriols. In der Postme-nopause werden mehr Katecholöstrogene ge-bildet als Östriol. Mit der Erstellung von Referenzbereichen für Katecholöstrogene waren die Voraussetzungen dafür geschaffen, die physiologische Bedeu-tung der Katecholöstrogene beim Menschen abzuschätzen. Während in zahlreichen Tierver-suchen eine pharmakologische Wirkung der 2-und 4-Hydroxyöstrogene auf die Regulation der Gonadotropinfreisetzung nachgewiesen werden konnte, lassen die vorliegenden Ergebnisse der Bestimmungen beim Menschen aufgrund gro-ßer Streubreiten eher den Schluß zu, daß Ka-techolöstrogene hauptsächlich Abbauprodukte des physiologisch wirksamen Östradiols sind und daß sie selbst wahrscheinlich keine eige-nen spezifischen Wirkungen ausüben. Diese Annahme wird zusätzlich dadurch gestützt, daß offenbar auch extrem hohe oder niedrige Kon-zentrationen keine pathophysiologischen Wir-kungen verursachen. 

Kinetik der Assoziation von Östrogenen

mit ihren korrespondierenden

Antiöstrogen-Antikörpern

Universität München: Elektronischen Publikationen

DG Klinische Chemie Mitteilungen 24 (1993) Heft 2 83 
Steroide als immunchemische Sonden 
und Immunglobuline als 
steroidanalytische Reagenzien 
R. Goebel 
Frauenklinik am Evangelischen Krankenhaus 
Oberhausen 
Im Jahre 1970/1971 wurden im Laboratorium 
für Klinische Chemie und Biochemie der I. Frau-
enklinik der Ludwig-Maximilians-Universität 
München Anti-Östrogen-C6-Konjugat-Antiseren 
entwickelt, die im Rahmen der Schwangeren-
überwachung als entscheidendes Reagenz bei 
der radioimmunologischen Östrogenbestim-
mung bis heute Bedeutung haben. Die bis da-
hin verwendeten Antiseren zur Bestimmung von 
Plasma- oder Serumöstrogenen im Radioimmu-
noassay zeigten eine deutliche Kreuzreaktivität 
mit anderen Steroiden. Aufgrund der praktisch 
zu vernachlässigenden Kreuzreaktivität der 
neuen Anti-Östrogen-Antisera mit anderen Ste-
roiden bestand die Möglichkeit, ohne vorherige 
Chromatographie die einzelnen klassischen 
Östrogene zu bestimmen. Die Vorteile der Se-
~~m-Östrogen-Bestimmung gegenüber der Urin-
Ostrogen-Bestimmung bestehen darin, daß kei-
ne Verzögerung bei der Bestimmung der Östro-
gene im 24-Stunden-Urin durch die 24stündige 
Sammelzeit und die möglichen Sammelfehler 
eintritt. Von wenigen Ausnahmen abgesehen, 
dürfte es keine Rolle spielen, ob das Gesamt-
östriol oder das unkonjugierte Östriol im Serum 
bestimmt wird. 
Der diagnostische Wert der Östriolbestimmung 
im klinischen EntscheidunJJsprozeß: Am häufig-
sten werden erniedrigte Ostriolkonzentrationen 
bei Schwangerschaften mit intrauteriner fetaler 
Wachstumsretardierung gefunden; häufig auch 
bei Patientinnen, bei denen eine schwanger-
schaftsinduzierte Hypertonie zu einer intrauteri-
nen fetalen Wachstumsretardierung geführt hat. 
Allerdings ist der prädiktive Wert des un-
konjugierten Östriols zur Erkennung einer feta-
len Dystrophie nicht sehr hoch (positiver prädik-
tiver Wert liegt bei 35%). Auch wenn die Östri-
olbestimmung im mütterlichen Serum im Kon-
zert der heutigen Überwachungsmethoden zur 
Bewertung einer Risikoschwangerschaft nicht 
mehr die hohe Rangordnung hat, wie es noch 
vor etwa 15 Jahren der Fall war, stellt sie den-
noch im Vergleich mit anderen chemischen 
Überwachungsmethoden die zuverlässigste 
chemische Methode zur Überwachung von Ri-
sikoschwangerschaften dar. 
Anschrift des Verfassers: 
Prof. Dr. R. Goebel, Evangelisches Krankenhaus, 
Frauenklinik, Virchowstraße 20, 
D-W 4200 Oberhausen 
Kinetik der Assoziation von Östrogenen 
mit ihren korrespondierenden 
Antiöstrogen-Antikörpern 
K.-P. Gloning 
I. Frauenklinik der Ludwig-Maximilians-
Universität München 
In Fortsetzung des Forschungsvorhabens "Ste-
roide als immunchemische Sonden" wurde die 
Kinetik der Assoziation von Östrogenen mit ih-
ren korrespondierenden Antiöstrogen-Antikör-
pern und die der Dissoziation der jeweiligen 
Komplexe untersucht, und es wurden die Reak-
tionsenergien und -enthalpien ermittelt. Die Er-
gebnisse können wie folgt zusammengefaßt 
werden: 
1. Im Gleichgewicht wurde die Bindung von 3H-
E2 an die Antikörper durch alle unmarkierten li-
ganden, die getestet wurden, signifikant ge-
hemmt. Die Non-Parallelität der Hemmungskur-
ven ist wahrscheinlich bedingt durch die Hete-
rogenität der Antikörper. Unter der Annahme, 
daß der Einfluß der Heterogenität der Bin-
dungsenergie ein Minimum bei einer Hemmung 
von 50% erreicht, wurde die Dosis, die 50% 
Hemmung bewirkt, gewählt, um eine Rangord-
nung der Haptene entsprechend ihrer 1050 
anzugeben. Diese Abfolge war gleich bei allen 
untersuchten Antiseren (Tab. 1). 
2. Die geringe Hemmung durch E2-~7 kann 
durch den Verlust· der Koplanarität des Mole-
84 DG Klinische Chemie Mitteilungen 24 (1993) Heft 2 
Tab. 1: Bindung von unmarkierten Östradiol-C6-De-
rivaten durch Anti-Östradiol-C6-Konjugat-Antiserum 
Relative Hemmung der 3H-E2 Bindung 
Die Konzentrationen, die erforderlich sind, die Bin-
dung von 3H-E2 durch das Antiserum um 7S%, SO% 
und 2S% von BO zu hemmen (ID2S' IDSß 1079, 
sind in bezug zu Ez=100% Hemmung angegeben. 
1075 1050 1025 
E2-117 3 0,6 0,1 
E2-116 112 95 85 
E2 100 100 100 
E2-6a-ol 50 52 54 
E2-6ß-ol 26 26 26 
E2-6-on 169 166 162 
E2-6-oxim-O-ME 73 121 200 
E2-6-CMO 58 93 150 
E2-6-.CMO-histamin 67 121 219 
E2-6-CMO-ACA 77 128 219 
E2-6-CMO-Lys 67 121 219 
küls nach Einfügen einer C7-C8-Doppelbindung 
leicht erklärt werden. Die Koplanarität des 
Östrogen moleküls ist nicht gestört durch die 
Doppelbindung an C6-C7. Demgemäß zeigte 
E2-86 eine Hemmung entsprechend E2. 
3. Die Hemmung von E2-6a-OH übersteigt die 
von E2-6j3-0H. Die äquatoriale 6a-OH-Gruppe 
paßt offenbar besser in die Bindungsstelle am 
Antikörper als die axiale 6j3-0H-Gruppe. 
4. Bei E2-6-on war die Hemmung eindeutig hö-
her als bei E2, und dieses Hapten zeigte die 
höchste Hemmung der Bindung, die. in dieser 
Untersuchung beobachtet wurde. E2-6-on wird 
für identisch mit dem steroidalen Kern der Im-
mundeterminante gehalten, einschließlich der 
sp2-Hybridisierung an C6. Das Ausmaß der 
Hemmung ist abhängig von der Assoziations-
konstante. Es ist daher bei Beachtung der ste-
roidspezifischen Antikörperfraktion sehr un-
k'2X 10,6 
(litre x mol" x s") 
wahrscheinlich, daß der Wert eines steroidalen 
Haptens für K, selbst wenn in der Brückenregi-
on mit einem großen Jodatom markiert wird, 
den K-Wert des reinen Steroids übersteigen 
würde, falls die molekulare Konformation der 
Immundeterminante entspricht. 
5. Die Werte für K hängen von bei den Ge-
sChwindigkeitskonstanten, der Assoziations-
und der Dissoziationsgeschwindigkeitskon-
stante k12 und k21 , ab. Weil sich die Geometrie 
von E2-6-on von E2-6-CMO-Lys deutlich unter-
scheidet, mag der niedrigere Wert für K des 
letzteren mehr von der niedrigeren Assoziati-
onsgeschwindigkeit bestimmt werden als von 
einer höheren Dissoziation, die Ausdruck der 
Affinität ist. 
6. Offenbar kann die Assoziationsreaktion un-
markierter Haptene mit Antikörpern durch die 
"Methode der sequentiellen Inkubation" zutref-
fend verfolgt werden: E2-6-on lagert sich 
schneller an als die Haptene mit längeren 
Brückengliedern. Unter diesem Gesichtspunkt 
sind die absoluten Werte der Geschwindigkeits-
konstanten weniger wichtig (Tab. 2). 
7. Die Dissoziationsreaktion des unmarkierten 
Hapten-Antikörper-Komplexes, beobachtet 
durch "sequentielle Inkubation", ist in einem Be-
reich bis 90% der anfänglichen Konzentration 
des Komplexes offenbar monophasisch. Die Er-
gebnisse zeigen eindeutig, daß E2-6-oxim-O-
ME durch den Antikörper am dichtesten gebun-
den wird, im Vergleich zum E2-6-on-Komplex 
mit der doppelten Halbwertszeit. Die Zuver-
lässigkeit der Reihenfolge der Affinität wird un-
terstützt durch die Halbwertszeit der Komplexe 
von E2-6a-OH, E2-6j3-0H und E2, deren Rei-
henfolge mit den Werten für die Hemmung die-
ser Haptene übereinstimmt. Es kann angenom-
Anti-E2-AS Anti-E2-As Anti-E2-As 
E2-6-on 
E2-6-oxim-O-ME 
E2-6-CMO 
E2-6-CMO-Lys 
02 E2 F2 
1,07 0,83 0,70 
0,45 0,45 0,43 
0,45 0,32 0,34 
0,36 0,36 0,35 
Tab. 2: Bindung von unmarkierten Östradiol-
C6-Derivaten durch Anti-Östradiol-C6-Konju-
gat-Antiserum 
Assoziationsgeschwindigkeitskonstante k 12 
DG Klinische Chemie Mitteilungen 24 (1993) Heft 2 85 
k21 X 104 t1/2 
(s-l) (m in) 
Anti-E2-As Anti-E2-As Anti-E2-AS 
D2 E2 
E2-6{3-0H 4,04 4,15 
E2-6a-OH 3,21 3,34 
E2 2,59 2,64 
E2-6-on 1,36 1,18 
E2-6-oxim-O-ME 0,58 0,61 
E2-6-CMO 0,64 0,68 
E2-6-CMO-histamin 0,64 0,64 
E2-6-CMO-Lys 0,93 0,92 
men werden, daß die Assoziationsgeschwin-
digkeiten gleich sind, da Unterschiede in der 
Geometrie dieser Moleküle nicht von Bedeu-
tung sind (Tab. 3). 
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß 
die "Methode der sequentiellen Inkubation" zur 
Bestimmung von Reaktionsgeschwindigkeiten 
eine zuverlässige Möglichkeit für immunche-
mische Affinitätsstudien darstellt. 
Die praktische Nutzanwendung der Ergebnisse 
dieses mehr theoretischen Konzeptes ergab 
sich bei der Suche nach einem geeigneten 125J_ 
markierten Indikator-Hapten für die radio-
immunologische Östrogen-Bestimmung. 125J als 
Indikator-Atom erleichtert als gamma-Strahler 
die Meßtechnik, es vermindert aber infolge 
seiner räumlichen Ausdehnung die Affinität des 
korrespondierenden Antikörpers, sofern es ein 
H-Atom im immundominanten Bereich des Li-
Abb. 1: Östriol-Konzen-
tration im Serum in der 
späten Schwangerschaft, 
bestimmt durch Radioim-
munoassay 
20 
~15 
! 
~ 
~ 
~1O 
~ 
~ 
A 
. " .. 
/~:~':.: 1. . 
/0 
F2 
3,91 
3,32 
2,64 
1,43 
0,59 
0,64 
0,66 
0,90 
28 
35 
45 
80 
200 
180 
180 
130 
Tab. 3: Bindung von unmarkierten 
Östradiol-C6-Derivaten durch Anti-
Östradiol-C6-Konjugat-Antiserum 
Dissoziationsgeschwindigkeitskon-
stante k21 und Halbwertszeiten 
ganden substituiert. Zur Markierung kann das 
Brückenglied des Immunogens herangezogen 
werden ("homologe Markierung"). Dies ist rela-
tiv einfach und wurde deswegen häufig prakti-
ziert. 
Diese Technik ist jedoch, wie oben gezeigt, mit 
mindestens einem Nachteil behaftet. Der korre-
spondierende Antikörper bindet Liganden mit 
Brückenglied mit höherer Affinität als Liganden 
ohne Brückenglied, zu denen im allgemeinen 
der Analyt gehört. Der Nachteil resultiert in 
verminderter analytischer Sensitivität der Be-
stimmung. Selektive Jodierung von Östrogen-
molekülen ohne Brückenglied ist in der Nach-
barschaft ihrer phenolischen Hydroxylgruppe an 
C2 und C4 relativ einfach zu erreichen. Nach 
den oben erwähnten Ergebnissen ist an-
zunehmen, daß ein J-Atom an C4 des Steroids 
vom Antikörper weniger gut "erkannt" wird als 
B 
20 
Korrelation der Ergeb-
nisse mit 2_ 125J (A) oder 
4_ 125J (B) und 3H-Östriol 
als Indikatorliganden '. o,~~--~-----__ ----__ __ 
o 5 10 15 
'l"'-----__ ----__ --~ 
5 10 15 
~-method estrkll [jJg/!] 3H-method estriol [IJQ/I] 
86 DG Klinische Chemie Mitteilungen 24 (1993) Heft 2 
ein J-Atom an C2, daß also für den Indikator 
C4-J-Östrogen eine etwa gleiche Affinität zu 
erwarten ist wie für den Analyt Östrogen, wor-
aus optimale analytische Sensitivität resultiert. 
Die Ergebnisse der jeweiligen Bindungsexperi-
mente (Auswertung über logit-Iog-Standardkur-
ven) und die Vergleiche mit anderen Analyse-
verfahren (Auswertung über standardisierte 
Hauptkomponente) brachten die empirische 
Bestätigung der theoretischen Ableitungen 
(Abb.1). 
Literatur 
Kuss, E., Dirr, W., Goebel, R., Gloning, K., 
Hötzinger, H., Link, M., Thoma, H. Steroids as 
immunochemical probes. Thermodynamic and 
kinetic data with special regard to the "bridge 
problem" in estrogen radioimmunoassay. In: 
Radioimmunoassay and Related Procedures in 
Medicine, International Atomic Energy Agency, 
1978; 1: 69-89 
2 Gloning, K., Dibbelt, L., Kuss, E. 2- and 4-
iodinated estriol as indicator ligands for estriol 
radioimmunoassays with anti-estriol-C6 conju-
gate antiserum. J. Immunol. Methods 1989; 122: 
185-193 
Anschrift des Verfassers: 
Dr. K.-P. Gloning, I. Frauenklinik der Ludwig-
Maximilians-Universität, Maistraße 11, 
D-W 8000 München 2 
Katecholöstrogene: Nur Objekte des 
Laboratoriums oder Effektoren des 
Organismus? 
FD. Berg 
I. Frauenklinik der Ludwig-Maximilians-
Universität München 
Katecholöstrogene (2-Hydroxyöstrogene, 4-
Hydroxyöstrogene) und ihre Methyläther sind 
Metabolite des Follikelhormons Östradiol-17ft 
Als ortho-Diphenole ähneln sie den Katechol-
aminen. Sie können also, zumindest formal, als 
Bindeglied zwischen den Östrogenen des 
Ovars und den Neurotransmittern des zentralen 
Nervensystems angesehen werden. 
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung 
zuverlässiger Analyseverfahren für serielle Be-
stimmungen dieser alkali- und oxidationsemp-
findlichen Substanzen und die Erstellung von 
Referenzbereichen ihrer Konzentrationen in 
Serum und Urin von Frauen im Menstruations-
zyklus, in der Schwangerschaft und in der Post-
menopause als Beitrag zur näheren Charakte-
risierung ihrer bisher unklaren physiologischen 
Bedeutung. 
Nach Synthese geeigneter Immunogene und 
125J-markierter Indikatorliganden wurden Anti-
körper induziert und radioimmunologische Ana-
Iyseverfahren mit hoher Spezifität, Empfindlich-
keit und Präzision entwickelt. 
Die Ergebnisse der Bestimmungen zeigten, daß 
die o-Hydroxylierung des aromatischen Ringes 
einen wichtigen Schritt im Stoffwechsel der 
Östrogene darstellt. Die Konzentrationsverläufe 
der Katecholöstrogene ähneln dem der "klassi-
schen" Östrogene (Östradiol, Östron, Östriol) im 
Zyklus und im ersten und zweiten Trimenon der 
Schwangerschaft. Im dritten Trimenon der 
Schwangerschaft steigt die Konzentration der 
Katecholöstrogene nicht mehr an, wohl aber die 
des Östradiol und des Östriols. In der Postme-
nopause werden mehr Katecholöstrogene ge-
bildet als Östriol. 
Mit der Erstellung von Referenzbereichen für 
Katecholöstrogene waren die Voraussetzungen 
dafür geschaffen, die physiologische Bedeu-
tung der Katecholöstrogene beim Menschen 
abzuschätzen. Während in zahlreichen Tierver-
suchen eine pharmakologische Wirkung der 2-
und 4-Hydroxyöstrogene auf die Regulation der 
Gonadotropinfreisetzung nachgewiesen werden 
konnte, lassen die vorliegenden Ergebnisse der 
Bestimmungen beim Menschen aufgrund gro-
ßer Streubreiten eher den Schluß zu, daß Ka-
techolöstrogene hauptsächlich Abbauprodukte 
des physiologisch wirksamen Östradiols sind 
und daß sie selbst wahrscheinlich keine eige-
nen spezifischen Wirkungen ausüben. Diese 
Annahme wird zusätzlich dadurch gestützt, daß 
offenbar auch extrem hohe oder niedrige Kon-
zentrationen keine pathophysiologischen Wir-
kungen verursachen. 


https://epub.ub.uni-muenchen.de/14368/1/Kolloquium_14368.pdf

Kinetik der Assoziation von Östrogenen mit ihren korrespondierenden Antiöstrogen-Antikörpern

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